[发明专利]一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法

权利要求书

1.一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于，所述MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法包括：

将经病理学检查确认为病变骨组织的标本置于含10％～12％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，培养皿四周事先铺好冰块，于无菌操作台内迅速移入内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的双抗的PBS液中洗涤3次～5次；用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织；用PBS液冲洗3次～5次后放入10％～12％胎牛血清的1640培养液浸泡；

使用眼科剪剪碎为0.5mm³大小的块状，使用0.15％胰酶消化分解切碎的样本；通过无菌240目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新100ml离心管内，用离心机1500rpm×5分钟分离细胞；清洗五次后1640培养液重悬而后加入10％～12％的胎牛血清6×10⁵细胞/毫升；最后MC3T3-E1细胞在5％～8％的CO₂ 37℃的环境下孵育培养；制成MC3T3-E1细胞悬液；

选择MC3T3-E1细胞，按2×10⁶mL^-1浓度接种于细胞培养瓶内，待细胞贴壁生长至细胞密度达80％时，加入不同浓度油酸作为诱导剂；以基础培养基DMEM添加体积比例为10％～12％的胎牛血清，分别添加25mM、50mM、100mM和200mM油酸四种浓度为成MC3T3-E1细胞的诱导培养基；每二天换液一次，以未加诱导培养液的细胞培养瓶作为对照，4周后油红O染色检测；

MC3T3-E1细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板从培养箱取出，小心吸去培养液，PBS清洗两次，不要损坏底层细胞；清洗后，每孔加入对应体积的hoechst33258工作液，室温20℃～25℃，避光孵育15min；弃染液，用PBS轻缓清洗两次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝360nm/480nm,检测荧光强度；弃去染液并用PBS清洗三次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，室温20℃～25℃，避光孵育10min；

将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长＝500nm/600nm,检测荧光强度；将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核进行观察并拍照。

2.如权利要求1所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于，制成MC3T3-E1细胞悬液后，还需进行：取制成MC3T3-E1细胞悬液步骤中的浓度为0.1-1.0mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmol/L的过氧化氢溶液；

去除原有α-MEM培养液，用正常α-MEM培养液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8毒性/增殖检测试剂，37℃避光孵育3小时；

在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。