[发明专利]快速检测流产亲衣原体病的引物及所构成的试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测流产亲衣原体病的引物，其特征在于，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

2.一种快速检测流产亲衣原体病的试剂，其特征在于，根据权利要求1的引物制备。

3.一种快速检测流产亲衣原体病的试剂盒，其特征在于，根据权利要求1的引物制备。

4.一种快速检测流产亲衣原体病的试剂盒，其特征在于，根据权利要求2的试剂制备。

5.一种快速检测流产亲衣原体病的试剂，其特征在于，根据权利要求1的引物制备。

6.一种快速检测流产亲衣原体病试剂的制备方法，其特征在于，主要包含以下过程：

Cp.abortus 16S rRNA基因的扩增及其重组质粒的构建：设计特异性引物，上游引物P1:5’-TGAACGCTGG CGGCGTGGATGAG-3’，下游引物P2:5’-AGTCATCAGCCTCACCTTGG GCGC-3’，以Cp.abortus分离株基因组DNA为模板，进行全长基因的扩增，并克隆至pMD18-T载体，获得重组质粒pT16SrRNA；

Cp.abortus 16S RRNA基因重组质粒拷贝数的确定：经系列倍比稀释，将pT16SrRNA质粒拷贝数稀释在1×10⁸～10⁰拷贝/μL之间；

Cp.abortus RPA引物的设计与合成：下载一定数量已知的的Cp.abortus不同流行株16S rRNA基因序列，对Cp.abortus 16s rRNA基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，设计若干对RPA引物，设计的RPA引物扩增目的片段大小为220～230bp，将RPA上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记；筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物；

RPA反应体系的配制及操作程序：配制40-60μL RPA反应体系，包括RPA FP和RPA RP(浓度为8-12μM)各2-3μL，Rehydration Buffer 28-32μL，dd H₂O 10-14μL，模板0.5-1.5μL，280mM MgAc 2-3μL,将所有试剂预混后，转入预添加Exo冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀,将0.5-1.5μL模板加入反应管中，并将2-3μL MgAc加在反应管盖中，混匀，盖紧后瞬时离心，放入38-42℃水浴锅中进行RPA反应2-30min。

7.根据权利要求6所述的快速检测流产亲衣原体病试剂的制备方法，其特征在于，所述具有高特异性和敏感性的检测RPA引物的筛选：

以Cp.abortus核酸样品(pT16SrRNA)为模板，分别用若干对Cp.abortus RPA引物进行RPA扩增，随后对扩增产物进行1-3％琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选。

8.根据权利要求6或7所述的快速检测流产亲衣原体病试剂的制备方法，其特征在于，将所述制剂制成试纸条，具体步骤如下：

胶体金标记抗体的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备平均颗粒直径为30-50nm的胶体金溶液，取8-12mL胶体金溶液，用0.1-0.3moL/L的K₂CO₃溶液调pH＝8.1-8.3，精密吸取0.5-1.5mL胶体金溶液加入试管中，向其中加入4-6μg小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，恒温缓慢振荡25-35min，分别加入8-12％的BSA溶液、0.5-1.5％的PEG-20000，继续振荡10-20min；3-5℃，12000-14000r/min，离心30-50min，缓慢弃去上清液，沉淀溶解于0.5-1.5moL/L的Tris-缓冲溶液中(pH＝7.9-8.1，含有0.5-1.5％BSA，0.03-0.06％Na3N)，即得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，将制备好的溶液低温密封保存，备用，

RPA-LFA试纸条的制备：RPA-LFA试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、金标垫、吸收垫、NC膜和PVC塑料垫,在NC膜上设置检测线(T线)和质控线(C线)；

首先，将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG均匀滴加喷到一张NC膜上，在真空干燥箱中36-38℃干燥8-12min，作为金标垫；

其次，在设有检测线(T线)和质控线(C线)的NC膜的膜检测线(T线)上包被经PBS缓冲液稀释至1-3mg/mL的链霉亲和素，质控线(C线)上包被1-3mg/mL的羊抗鼠IgG，室温下干燥25-35min；

组装的顺序分别为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上设有检测线(T线)和质控线(C线)NC膜，金标垫贴在该NC膜的前方区域，金标垫压NC膜1-3mm，再在金标垫的前方贴上样品垫，样品垫压金标垫1-3mm，最后将吸收垫贴在NC膜的后方，吸收垫压NC膜1-3mm，低温保存备用。