[发明专利]一种基于纳米抗体检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种检测二乙氧基有机磷农药残留的免疫学试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有纳米抗体作为检测抗体，纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，

所述试剂盒为ELISA试剂盒，该试剂盒还包括：包被含二乙氧基有机磷农药抗原的酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗溶液、二乙氧基有机磷农药标准溶液、底物液、底物缓冲液、终止液、浓缩洗涤液；

所述二乙氧基有机磷农药为对硫磷、喹硫磷、三唑磷、蝇毒磷、甲拌磷、乙拌磷、乙基溴硫磷、除线磷、乙基谷硫磷、伏杀硫磷、特丁硫磷或辛硫磷中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的免疫学试剂盒，其特征在于，所述纳米抗体的浓度为850ng/ml。

3.根据权利要求1所述的免疫学试剂盒，其特征在于，所述包被抗原为二乙氧基有机磷农药半抗原与载体蛋白的偶联物，浓度为1000ng/ml，其中二乙氧基有机磷农药半抗原的化学式为：

4.根据权利要求1所述的免疫学试剂盒，其特征在于，所述二乙氧基有机磷农药标准溶液为浓度分别为500ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、1.95313ng/mL、0.48828ng/mL、0.12207ng/ml，0ng/mL的对硫磷农药标准溶液。

5.根据权利要求1所述的免疫学试剂盒，其特征在于，所述底物液为过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；

所述底物缓冲液为含有3,3,5,5-四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；

所述终止液为5％～10％硫酸溶液或2mol/L的氢氧化钠溶液；

所述浓缩洗涤液为含有0.5％～1.0％吐温20的0.01mol/L，pH 7.4磷酸盐缓冲液；

所述的浓缩洗涤液使用时用去离子水稀释10～20倍；

所述酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的抗HA标签抗体。

6.权利要求1～5任一所述试剂盒在检测二乙氧基有机磷农药中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述二乙氧基有机磷农药为对硫磷、喹硫磷、三唑磷、蝇毒磷、甲拌磷、乙拌磷、乙基溴硫磷、除线磷、乙基谷硫磷、伏杀硫磷、特丁硫磷或辛硫磷中的任意一种。

8.权利要求1～7任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将试剂盒从冷藏环境里取出，置于室温条件下平衡；

S2.将50μL二乙氧基有机磷农药标准品溶液或经前处理的待测样品溶液加入试剂盒的酶标板微孔中，然后每孔加入50μL二乙氧基有机磷农药纳米抗体，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育40min；

S3.用洗涤液对酶标板微孔进行洗涤，拍干；

S4.每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的山羊anti-HA antibody-HRP二抗，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育30min；

S5.用洗涤液对酶标板微孔进行洗涤，拍干；

S6.将底物液和底物缓冲液等体积混合后得到酶联免疫检测显色液，向每孔中加入100μL显色液，轻微震荡混匀，37℃环境中孵育10min；

S7.每孔加入终止液，轻微震荡混匀，在450nm波长下用酶标仪测定酶标板微孔的吸光值；

S8.以药物标准液浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度微孔吸光值与零标准品微孔吸光值比值为纵坐标，绘制标准曲线图，从而根据待测样品的吸光值来计算样品中二乙氧基有机磷农药的含量。