[发明专利]一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，命名为E.coli HECT06，是以大肠杆菌为出发菌株，在其基因组上做如下改造而得到的：在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子PxylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，阻止L-天冬氨酸-β-半醛向分支代谢产物苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的支路代谢；通过整合来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因，由强启动子P_T7启动，解除赖氨酸对四氢嘧啶合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶Ask的反馈抑制；整合来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，并由强启动子P_T7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子P_T7启动。

2.根据权利要求1所述的高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli W3110，保藏号ATCC 27325。

3.根据权利要求1所述的高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：所述木糖启动子PxylF具有序列表1所示核苷酸序列；所述RNA聚合酶T7RNAP具有序列表2所示核苷酸序列；所述thrA基因具有序列表3所示核苷酸序列；所述lysC基因具有序列表4所示核苷酸序列；所述强启动子P_T7具有序列表5所示核苷酸序列；所述ectABC基因簇来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329；所述ectABC基因簇具有序列表6所示核苷酸序列；所述编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因来源于H.elongata，保藏号CGMCC No.1.6329；所述ectD基因具有序列表7所示核苷酸序列。

4.权利要求1所述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，具体步骤如下：

(1)在大肠杆菌基因组上，将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶T7RNAP基因整合在lacZ基因位点；

(2)为了减弱天冬氨酸支路代谢，将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因敲除；

(3)为增加前体物天冬氨酸半醛的供应，将来源于谷氨酸棒状杆菌的编码天冬氨酸激酶的lysC基因整合在yghX基因位点；

(4)将四氢嘧啶合成基因簇ectABC整合到ybeM基因位点，重构四氢嘧啶合成途径；

(5)将四氢嘧啶羟化酶基因ectD整合到trpR基因位点，重构羟基四氢嘧啶合成途径；

(6)为增加α-酮戊二酸量以提高EctD酶活，将ectD基因整合在编码琥珀酰辅酶A合成酶的sucCD基因位点。

5.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产羟基四氢嘧啶方面的应用。

6.根据权利要求5所述基因工程菌的应用，其特征在于：具体方法为：

摇瓶发酵：

将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2mL60％(m/v)葡萄糖溶液，发酵初始添加60％(m/v)木糖溶液诱导目的基因表达，发酵周期22-26h；或

发酵罐发酵：

将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在30-40％；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期36-40h。