[发明专利]一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用，所述菌株在大肠杆菌基因组上整合了由木糖启动子控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶；敲除了编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因；整合了来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC基因、来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongate的ectABC基因簇以及编码四氢嘧啶羟化酶的ectD基因，均由强启动子P_T7启动，重构了羟基四氢嘧啶合成途径；在琥珀酰辅酶A合成酶sucCD位点整合了ectD基因，由强启动子P_T7启动；是目前报道的发酵法生产羟基四氢嘧啶的最高水平。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)是一种极性、易溶、生理pH范围内不带电荷的小分子有机物，最初是在Streptomyces parvulus中发现的。近年来，羟基四氢嘧啶在微生物细胞中作为相容性溶质已被广泛研究。研究发现，羟基四氢嘧啶不仅具有渗透调节功能，还可以在高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境中保护和稳定核酸、细胞膜、蛋白质等物质的结构，并且羟基四氢嘧啶对蛋白的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相容性溶质。目前羟基四氢嘧啶已经广泛应用于在医药、基因工程、化妆品等领域。

在医药领域的应用：羟基四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经系统疾病的治疗，还可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂，另外羟基四氢嘧啶还有增强人工肺表面活性剂的作用；在基因工程技术领域的应用：羟基四氢嘧啶可以提高双链DNA的解链温度，因此可以作为聚合酶链式反应的增强剂；在化妆品中的应用：基于羟基四氢嘧啶的渗透保护功能，羟基四氢嘧啶可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害。

现阶段极少有关于微生物发酵法生产羟基四氢嘧啶的报道，由于嗜盐微生物中具有羟基四氢嘧啶的合成途径，因此仅有的报道中也大多是在中度嗜盐菌中发酵生产羟基四氢嘧啶。如Hisayo Ono等在NaCl浓度为2.56M时，在伸长盐单胞菌Halomonas elongate KS3中发酵生产羟基四氢嘧啶浓度达到45μg/mgBDM；也有将四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶合成基因簇完整的拷贝到大肠杆菌中来发酵生产羟基四氢嘧啶，如Britta Seip等通过向大肠杆菌DH5α中导入来自于施氏假单胞菌的基因簇使其中羟基四氢嘧啶产量在低盐浓度下(2％NaCl)达到500μmol/(g DBM)。目前报道的羟基四氢嘧啶生产方法均产量低，达不到羟基四氢嘧啶的工业生产要求，另外，利用嗜盐菌发酵生产羟基四氢嘧啶需要高渗透压，因此对发酵设备要求高、损耗大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述高产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：