[发明专利]一种检测MTRR基因SNP位点基因分型PCR引物和方法

说明书

本发明公开了一种检测MTRR基因rs1801394多态性位点基因型的方法及试剂盒，其基于PCR‑RFLP法检测MTRR基因rs1801394位点的基因型，PCR产物带有NdeI或其同裂酶的内对照酶切位点，使用快速限制性核酸内切酶酶切PCR产物，得到限制性酶切图谱用于基因分型，可以缩短分型时间。同时可根据残留的PCR产物、残留的酶切中间产物和各基因型样品完全酶切后本应出现的特征条带来对结果作出综合判断，避免了传统方法因酶切不完全造成的基因型误判。

技术领域

本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测MTRR基因SNP位点(即rs1801394多态性位点)基因分型的PCR引物和方法。

背景技术

叶酸对人体具有重要的生理功能，但是人体自身不能合成叶酸，必须从食物摄取。叶酸补充不足或利用能力差均会造成叶酸缺乏，导致高同型半胱氨酸血症，增加动脉粥样硬化、血栓生成和高血压的危险性；叶酸缺乏还可引起DNA的低甲基化，增加一些癌症的危险性；孕妇缺乏叶酸会导致胎儿出生缺陷，孕妇自身也会出现很多不良症状，但叶酸补充过量也会引发各种副作用。

甲硫氨酸合成酶还原酶即5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶还原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase，MTRR)为叶酸代谢通路的关键酶之一。MTRR的主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，而甲硫氨酸合成酶可以协助甲硫氨酸、四氢叶酸和同型半胱氨酸维持在适当的浓度水平。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一，而同型半胱氨酸、叶酸的代谢与Down综合症(先天愚型)、神经管疾病、心血管疾病等疾病相关，因此MTRR突变被认为是这些疾病的高风险因素。

MTRR基因定位于染色体5p15.2-15.3，序列长度为32,021bp(参见GenBank相关数据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_008856.1)，编码698个氨基酸残基的多肽链(参见GenBank相关数据https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002445.2)，MTRR基因rs1801394单核苷酸多态性位点(dbSNP序列数据见图1，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示)是其开放读码框第66位碱基A→G(A66G，对应于GenBank中mRNA序列NM_002454.2的203位碱基或基因组序列NG_008856.1的6757位碱基)，引起其编码的酶蛋白(第22位氨基酸)由异亮氨酸(Ile)变为蛋氨酸(Met)(Ile22Met，I22M)，该突变导致其酶活及同型半胱氨酸的甲基化速率降低，引起相关疾病的发生。在dbSNP数据库中，世界人群中的该多态性位点等位基因的频率分布为：A占57.4％，G占42.6％左右。在中国人群中该多态性位点等位基因的频率分布为：A占75％，G占25％左右。

目前，检测MTRR基因rs1801394基因型的方法有PCR-RFLP法、测序法、荧光PCR、基因芯片等。除了PCR-RFLP法外，其他方法均需昂贵设备或试剂、素质要求高的人员、繁琐的操作、高的检测成本。PCR-RFLP法操作简单，对仪器设备要求低，便于应用。文献报道该位点主要采用限制性核酸内切酶NdeI进行检测，也有个别实验室采用限制性核酸内切酶NspI进行检测，但后者的成本要高于前者，以Thermo Scientific^TM公司的快酶为例，NspI为576元/50次，而NdeI为540元/300次，即前者的成本是后者的6倍多。无论是采用NdeI还是NspI酶切，使用现有的方法出现酶切不完全的情况时，皆有可能引起基因型误判,具体分析如下: