[发明专利]重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组糖基化蛋白P39的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、真核表达载体pPICZαA-P39的构建

对p39基因进行克隆，将PCR后的片段与克隆载体pMD-19T(Simple)相连，经测序和酶切验证正确后，将双酶切后获得的目的片段与同样经双酶切的真核表达载体pPICZαA相连构建重组表达质粒pPICZαA-P39；

步骤二、P39蛋白在毕赤酵母GS115中的表达、纯化及发酵

利用电转化法将构建好的真核表达载体pPICZαA-P39转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇进行蛋白的诱导表达，应用亲和层析方法对目的蛋白进行纯化，并利用分子筛进一步分离纯化目的蛋白，并利用westernblot对纯化的蛋白进行验证，通过优化单因素实验得到最佳发酵条件为：pH值为6、磷酸盐浓度为0.02M、甲醇诱导浓度为1％、诱导72h，纯化后的重组蛋白P39浓度为5mg/ml。

2.根据权利要求1所述的重组糖基化蛋白P39的制备方法，其特征在于，步骤二中，真核表达载体pPICZαA-P39转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中的具体过程如下：

1、重组表达质粒pPICZαA-P39的提取

挑取培养的单个菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜后扩大培养过夜：

(1)收集40ml菌液放入50ml离心管中，10000rpm，离心3min，多收集几次后，弃掉上清，倒置在滤纸上；

(2)向有沉淀的50ml离心管中加入10mlP1溶液，同时加入50ul TIANRED试剂，利用移液枪吹打混匀或用振荡器混匀；

(3)向离心管中加入10mlP2溶液，温和的上下翻转6-8次，使菌体裂解，室温放置5min；

(4)向离心管中加入10mlP4溶液，温和的上下翻转6-8次，至溶液出现白色分散絮状沉淀，室温放置10min，10000rpm离心5-10min；

(5)将全部溶液小心倒入过滤器中，过滤，自备50ml离心管；

(6)向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇，和1/2异丙醇体积的5M Nacl溶液，上下颠倒混匀；

(7)在4℃条件下，10000rpm离心30min，倒掉上清，将其倒置在滤纸上吸水；

(8)向管中加入6ml 70％的乙醇充分漂洗沉淀，4℃，10000rpm离心10min，倒掉上清，将其倒置在滤纸上；

(9)重复第7步；

(10)将离心管敞口放在室内10-20min，使乙醇挥发后加入1-1.5mlTB buffer溶解，Nano Drop检测质粒浓度；

2、重组表达质粒pPICZαA-P39的线性化

将提取的重组表达质粒pPICZαA-P39利用SalI进行线性化，反应体系如下：质粒20μl、SalI限制性内切酶5μl、bufferH 5μl、ddH₂O 20μl，共20个样品；37℃水浴3h；取5μl进行核酸电泳检测酶切是否完全，未酶切质粒作对照；

3、醇沉淀法回收线性化的质粒

吸取酶切后的500ul质粒至1.5ml的离心管中，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇，均匀混合，4℃条件下，12000rpm离心10min；取上层上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的5M Nacl溶液，-20℃条件下静止2h；在4℃条件下，13000rpm离心10min，弃掉上清；用75％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min；自然晾干至乙醇完全挥发，10ul TB buffer回溶，沉淀即为线性化质粒，Nano Drop检测核酸浓度；

4、电转化毕赤酵母GS115感受态细胞

取10ul经过SalI线性化后的质粒加入100ul的毕赤酵母GS115感受态细胞，混匀后加入0.1cm预冷的电击杯中，冰浴5min，在电压为1.8kV，电击时间4-5ms的条件下进行电转，电转后加入1M山梨醇1ml，将其转移至灭过菌的2ml离心管中，30℃，250rpm的条件下孵育2h；取200ul进行涂板，不同浓度的zeocin抗性平板。