[发明专利]重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用

说明书

一种重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用，涉及重组蛋白领域。本发明包括：对p39基因进行克隆，将PCR片段与克隆载体pMD‑19T(Simple)相连，经测序和酶切验证正确后将目的片段与真核表达载体pPICZαA相连构建重组表达质粒pPICZαA‑P39；电转化法将质粒pPICZαA‑P39转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，经诱导表达，亲和层析纯化，分子筛进一步分离纯化后经western blot验证即为目的蛋白，最佳发酵条件为：pH6、磷酸盐浓度0.02M、甲醇诱导浓度1％、诱导72h，纯化后的重组蛋白P39浓度为5mg/ml。本发明为布鲁氏菌流行性疾病免疫预防奠定基础。

技术领域

本发明涉及重组蛋白技术领域，具体涉及一种重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用。

背景技术

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患的传染病，在世界各地都广泛流行，尤其是在发展中国家，目前，尚无有效的商品化人用疫苗，而动物疫苗多为弱毒苗，具有一定的毒性和致病力，难与自然感染区分开来，因此，研究有效的疫苗是控制动物布病的主要方法。目前，现有的有效布鲁氏菌疫苗种类有死疫苗、减毒活疫苗等，减毒活疫苗免疫效果较好。现有的畜用减毒活疫苗有S19、Rev.1、RB51、S2和M5等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。国内外现行布鲁氏菌疫苗对牲畜的保护力一般是70～80％，因此，单依靠接种疫苗来消除布鲁氏菌病是不实际的。牛用RB51粗糙型突变株疫苗开辟了布鲁氏菌病防治的新领域，有效地提升了布鲁氏菌病的防治效果，但在短时期内就会在体内中被清除。疫苗应用较为广泛，在许多国家和地区将Rev-1疫苗免疫3-6个月龄的羔羊，他们认为Rev-1对羊有100％的保护性，接种过此疫苗的地区，人患布病发病率显著减少，但是此疫苗对人有感染性，需要对兽医人员要采取严格的保护措施。且减毒活疫苗存在毒力恢复以及隐性感染等危险外，而且会对当前广泛采用的血清学诊断方法造成干扰，使得无法区分感染动物和免疫动物，对布病的彻底净化根除造成了一定的干扰和困难。S19减毒株对牛和绵羊免疫效果好且效果稳定，但对羊的免疫效力较差，对猪无效。另外，S19减毒疫苗有毒力返祖现象，会引起怀孕牛的流产。Rev.1和RB51都是突变株疫苗，应用较为广泛，但是一旦突变株的疫苗毒力返强，后果将不堪设想。M5菌株被广泛应用于羊布鲁氏菌的预防，但该疫苗也会引起怀孕母畜的流产，且不利于鉴别诊断。

目前，科研工作者已经开始利用基因工程和分子生物学手段对已知的免疫原性蛋白进行基因工程苗的研发。研究发现一些保护性抗原分子有BCSP31、OMP25、L7/L12、P39、CuZn SOD及热休克蛋白等。新型疫苗主要有DNA疫苗、重组蛋白疫苗和抗独特型抗体疫苗等。DNA疫苗的研制获已取得了一些成果，但由于其免疫保护性不高，目前还没有DNA疫苗可以较好的保护动物免受致病株的攻击。随着牛种和羊种布鲁氏菌全基因组测序的完成，科学家们对布鲁氏菌各种基因的功能认识越来越透彻，研制基因缺失弱毒苗融合蛋白重组疫苗、以及蛋白修饰疫苗等新型布鲁氏菌基因工程疫苗成为他们研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组糖基化蛋白P39及其制备方法和应用，为系统研究其作为一种新型的疫苗和免疫佐剂在布鲁氏菌流行性疾病免疫治疗中的作用奠定基础。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种重组糖基化蛋白P39的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、真核表达载体pPICZαA-P39的构建

对p39基因进行克隆，将PCR后的片段与克隆载体pMD-19T(Simple)相连，经测序和酶切验证正确后，将双酶切后获得的目的片段与同样经双酶切的真核表达载体pPICZαA相连构建重组表达质粒pPICZαA-P39；

步骤二、P39蛋白在毕赤酵母GS115中的表达、纯化及发酵