[发明专利]一种致敏胶乳的制备方法及试剂盒

说明书

一种致敏胶乳的制备方法及试剂盒，属于医药试剂技术领域。本发明的目的是利用切向流过滤系统浓缩换液的方法制备致敏胶乳的方法及试剂盒。本发明步骤是：准备EDC溶液；得到活化的胶乳微球；将活化的胶乳微球与偶联缓冲液混合；将胶乳微球与抗体偶联；加入牛血清白蛋白母液；将溶液与储存缓冲液混合液进行过滤即得到致敏胶乳。本发明的有点是克服了因用离心机、细胞超声破碎仪导致的偶联效率低、试剂不稳定、出现黑色沉淀和空白吸光度大的缺陷，同时更利于批量生产。

技术领域

本发明属于医药试剂技术领域。

背景技术

胶乳增强免疫比浊法（Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA）是一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。其原理通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。

LETIA法需要采用物理或者化学的方法将抗体偶联在微球表面，物理吸附法，是由于蛋白质和胶乳颗粒之间是以静电相互作用或者是疏水相互作用结合在一起的，是一种弱的作用力，所以蛋白很容易从胶乳微球上解离下来，造成试剂的不稳定、偶联效率低，在实际应用上受到一定的限制。化学偶联法，是通过胶乳微球表面的功能基团与免疫活性分子上的氨基以共价键的形式结合在一起，增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。所以目前国内的研发，大部分采用化学偶联法，即利用碳化二亚胺活化羧基，然后加入抗体偶联而做成的胶乳增强比浊试剂。

化学偶联法分为：一步法（不将多余的活化剂分离）、二步法（活化后，除去多余的活化剂），而活化剂的分离主要采用离心机高速离心的方法分离，胶乳微球的粒径越小，所需要的离心力越大，离心时间越长。微球与抗体偶联后也主要是采用离心机分离后，乳胶沉淀在换液分散，少量生产采用低功率的超声清洗设备进行分散，批量生产则采用超声细胞破碎仪进行分离，由于重复的超声，超声细胞破碎仪的变幅杆下端变的坑坑洼洼，会有黑色东西掉入溶液中，随着时间的延长，试剂变的不稳定。另外，由于超声的功率不确定，以及超声温度的影响，存在产生变性IgG的可能，所以容易造成RF的干扰。

发明内容

本发明的目的是利用切向流过滤系统浓缩换液的方法制备致敏胶乳的方法及试剂盒。

本发明步骤是：

（1）准备：准备60-300nm的聚苯乙烯胶乳微球，胶乳微球用pH6.0的50mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为1-3%w/v得到胶乳微球溶液；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）用pH6.0的50mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸溶解，得到浓度为0.01g/mL的EDC溶液；

（2）活化：以胶乳微球的重量为计，每mg微球按10-100μL EDC溶液的比例滴加到胶乳微球溶液中，震荡混匀，10-37℃震荡活化20-30min，震荡速度为50-200rpm/min，得到活化的胶乳微球；

（3）换液：将活化的胶乳微球倒入切向流过滤系统的样品容器中，将偶联缓冲液倒入清洗液容器中，在仪器上设置目标泵速为30-60mL/min、跨膜压力为2.5Psi、剪切力为2000-4000s^-1，参数设置完成后按开始键进行过滤，偶联缓冲液的体积为待过滤胶乳微球体积的3-6倍，按结束键停止过滤，整个过程控制在1h之内；

（4）偶联：以胶乳微球的重量为计，按微球：抗体=0.1-0.5%的比例将抗体加入到溶液（3）中，震荡混匀，10-37℃震荡偶联2-3h，震荡速度为50-200rpm/min；

（5）封闭：按溶液的终体积为0.5-2%的比例将5%牛血清白蛋白母液加入到溶液（4）中，震荡混匀，10-37℃震荡封闭1-2h，震荡速度为50-200rpm/min；