[发明专利]一种微生物转化法制备达木林A的方法

说明书

本发明公开了一种微生物转化法制备达木林A的方法，包括孢子和种子制备、微生物转化、转化产物收集和分离纯化。本发明发现，转化原料为绞股蓝皂苷LI时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林A；转化原料为绞股蓝皂苷L时，短刺小克银汉霉AS3.153菌株会将其基本都转化为达木林B。绞股蓝皂苷LI、绞股蓝皂苷L的C20位羟基的构型决定了短刺小克银汉霉AS3.153菌株的脱水选择性，短刺小克银汉霉AS3.153菌株对该位置的脱水具有选择性，可以选择性制备达木林A或达木林B，原料利用率高。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微生物转化法制备达木林A的方法。

背景技术

绞股蓝中含有的皂苷成分众多，研究较多、活性较好的有绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI、达木林A(DamulinA)和达木林B(DamulinB)。

达木林A和达木林B在绞股蓝生品中的含量极低，为稀有皂苷。绞股蓝经过加热炮制后，达木林A和达木林B的含量会显著升高，这是因为高温导致绞股蓝皂苷LVI、XLVI脱糖基得到绞股蓝皂苷L、LI，再进一步发生C20(21)、C20(22)脱水得到达木林A和达木林B。绞股蓝皂苷LVI、XLVI、L、LI向达木林A和达木林B的转化途径如下所示。

从化学式可知，达木林A和达木林B为双键位置异构体。因为加热脱水缺乏选择性，所以通过加热脱水的方式会同时得到达木林A和达木林B，二者含量比约为1:1。

微生物转化是替代天然产物结构修饰的一种方法。它具有很高的区域选择性、立体选择性和基团选择性，可以完成一些化学方法难以进行的反应，选择性制备特定结构的化合物。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物转化法制备达木林A的方法。

上述目的通过如下技术方案实现：

一种微生物转化法制备达木林A的方法，包括通过如下步骤：

步骤S1，孢子和种子制备：将短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基上，置于28℃恒温培养7d，得到菌丝生长旺盛、孢子丰富的培养物；取适量孢子接入种子瓶，于28℃振荡培养24h，得到种子培养物；

步骤S2，微生物转化：以5％的接种量将种子培养物转至转化瓶，28℃振荡预培养24h后加入绞股蓝皂苷LI无菌水溶液，使绞股蓝皂苷LI终浓度为0.2g/L，28℃振荡培养96h；

步骤S3，转化产物收集：取转化培养物上清液，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩得到转化产物粗品；

步骤S4，将转化产物粗品上样于正相硅胶柱，硅胶径高比为1:10，拌样硅胶占硅胶总量的1/10，干法装柱，拌硅胶上样；依次用体积比为40:1:2、20:1:2的二氯甲烷/甲醇/丙酮混合溶剂以12BV/h的速度梯度洗脱，分别洗脱8BV、10BV；收集20:1:2二氯甲烷/甲醇/丙酮洗脱9-10BV的洗脱液浓缩干燥得到达木林A。

优选地，斜面培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，成分为：蔗糖1.5g，琼脂2.0g，马铃薯20g和蒸馏水100ml。

优选地，种子瓶和转化瓶培养基成分为：葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水100ml，pH调至8.3。

优选地，培养基均于115℃灭菌30min后使用。

优选地，步骤S1中，短刺小克银汉霉AS3.153菌株接种于斜面培养基之前于4℃保存。

优选地，步骤S1中，用无菌接种环取一环富含孢子的菌丝体，仅将孢子接入种子瓶中。

本发明技术优势：