[发明专利]一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法

权利要求书

1.腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：

（1）水牛卵母细胞体外培养：将屠宰场收集的水牛卵巢保存在39℃生理盐水中于1～2小时内送到实验室，去除卵巢系膜和输卵管多余组织，接着使用含双抗的生理盐水清洗，清洗后抽取直径为2～6mm的卵泡中的卵母细胞，然后选取胞质均匀、胞外有3层以上的颗粒细胞的水牛卵母细胞，洗涤后置于成熟培养液中于39 ℃、5% CO₂、饱和空气湿度的培养箱中培养；

（2）体外受精：

将水牛冻精解冻后在爬高液内培养30min，

将于成熟培养液中培养22～24h后的水牛卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞吹打掉后，置于受精盘微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；

将爬高培养后的 精子经过洗涤后加入上述受精盘微滴中，控制精子浓度1×10⁶个/mL～1.5×10⁶个/mL，将受精盘置于39 ℃、5% CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养；

（3）单层共培养系统的制备：

将吹打掉的卵丘颗粒细胞吹打均匀后制成30μL/滴的微滴盘单层共培养系统，覆盖石蜡油，于39 ℃、5% CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养；

（4）胚胎体外培养：受精培养18h后将附着于受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗2～3遍后置于单层共培养系统中，于39 ℃、5% CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养，记录胚胎各个阶段发育情况，将发育后待感染胚胎的透明带部分消化后置于微滴盘单层共培养系统中继续培养；

所述待感染胚胎的透明带部分消化的操作方法如下：

将受精卵置于含3.3 mg/mL Pronase的CM液滴中，在显微镜下观察胚胎消化全过程，并记录视野范围内第一个胚胎透明带开始变形的时间，将这个时间定义为 First time，然后继续消化反应，并记录该胚胎透明带消失的时间，将这个时间定义为 End time，经过 5 次重复试验后计算出 First time和End time的平均时间；利用平均时间，将受精卵放入含有3.3 mg/mLPronase的CM液滴中开始消化，First time后开始观察受精卵透明带变形情况，当透明带开始变形时立即把受精卵移到含10%FBS的CM培养液中终止消化，但仍然要继续观察受精卵的消化情况，直至透明带变到最薄又不破的时候，转移到含10%FBS的CM培养液中完全终止消化，在含10%FBS的CM培养液中洗2～3次后放入含10%FBS的CM培养液滴中，并在39 ℃、5% CO₂、饱和空气湿度的培养箱中培养备下一步试验用；其中整个消化处理时间不超过End time的平均时间；

（5）腺病毒载体的包装及腺病毒扩增：

A、收集腺病毒上清：

将293细胞计数后按照70%的细胞密度接种于60 mm培养皿，按转染试剂Lipofectamine^R3000说明书进行转染，其中质粒按pBHGloxdelE13cre：pDC316-eGFP=2:1比例加入；期间添加培养液，转染后第10天，90%的细胞变圆而且其中60%细胞脱离培养皿底部后，用细胞刮刀收集细胞，细胞经液氮、37℃水浴反复冻融4～5次后，离心并收集腺病毒上清；

B、腺病毒扩增：

准备密度为70%的100 mm培养皿的293细胞，加入以上收集的病毒上清，扩增腺病毒，再次重复步骤A的方法收集腺病毒上清，用于后续试验或冻存于-80℃冰箱备用；

（6）腺病毒滴度稀释：

取腺病毒扩增后的腺病毒上清滴度为1 GFU/mL的腺病毒液，分别用胚胎培养液TCM199+10%FBS进行10倍连续稀释，获得滴度分别为1 GFU/mL、1×10^-1 GFU/mL、1×10^-2 GFU/mL、1×10^-3 GFU/mL、1×10^-4 GFU/mL、1×10^-5 GFU/mL的病毒液，置于-80℃冰箱备用；

（7）腺病毒感染水牛颗粒细胞：

a、取1 GFU/mL、1×10^-1 GFU/mL、1×10^-2 GFU/mL、1×10^-3 GFU/mL、1×10^-4 GFU/mL、1×10^-5 GFU/mL 、0 GFU/mL 浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的浓度；

b、取最佳感染水牛颗粒细胞浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h、96h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的时间；

所述水牛颗粒细胞单层为在步骤（3）中单层共培养系统中培养成功的单层细胞；

（8）腺病毒感染水牛胚胎：

选择步骤（7）中最佳浓度的腺病毒液与于步骤（4）的微滴盘单层共培养系统中培养的待感染胚胎于胚胎培养液感染获得腺病毒介导的水牛转基因胚胎，感染的时间长为步骤（7）中的最佳感染时间；

所述胚胎培养液为TCM199+10%FBS+0.1%～0.5%灰树花多糖+0.01%～0.05%螺旋藻多糖。