[发明专利]一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：具体步骤包括水牛卵母细胞体外培养；体外受精；单层共培养系统的制备；胚胎体外培养；腺病毒载体的包装及腺病毒扩增；腺病毒滴度稀释；腺病毒感染水牛颗粒细胞；腺病毒感染水牛胚胎，获得腺病毒介导的水牛转基因胚胎。本发明具有的优点是：采用本发明的技术方案将腺病毒介导感染水牛转基因胚胎，水牛胚胎卵裂率、桑囊率、转染囊胚率均有明显的提高，能够大大的提高转染的效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法。

背景技术

动物转基因技术自诞生之日起，就广泛运用于畜禽生产性状的改良、提高畜禽抗病力、非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)的生产、人类疾病模型、生物反应器和生产人类器官等方面。然而，转基因动物的低效率是制约该项技术发展的关键。传统的转基因胚胎生产方法一般为原核注射法、ICSI-Tr法、体细胞克隆法和腺病毒载体法。由于水牛受精卵内分布的脂肪滴较多，在显微镜下无法清晰地看到原核，且外源基因整合效率随机不定，整体效率较低，因此不适宜采用原核注射技术生产转基因水牛胚胎。相比较原核注射而言，ICSI-Tr注射针口径较大，虽然对染色体的损伤较小，但是会损失较多的细胞质，且需要用到显微操作系统，过程较繁琐，效率较低。体细胞克隆转基因法采用细胞导入法，虽然能较稳定将外源基因导入，但该法除了操作繁琐效率低以外还需克服外源基因重组所带来的异常表观遗传修饰模式。

本发明人在《中国畜牧兽医》2016,43(10)：2661-2665中的《腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较》疑问中就有关于腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的研究；但是该项技术并没有披露有关于用腺病毒载体转染水牛胚胎的任何技术披露；传统的腺病毒载体法只是笼统地将腺病毒感染受精卵，而未考虑到受精卵自身的特点和生长环境因素，因水牛胚胎体外生长需要颗粒细胞共培养，而且水牛受精卵内脂滴较多，透明带较厚，一般的病毒难以携带外源基因高效通过，转基因生产的效率较低；其次，在腺病毒感染水牛胚胎过程中将透明带消化，降低了透明带对外源物质进入胚胎的阻滞，本发明从共培养体系中的水牛颗粒细胞腺病毒感染着手，在不破坏水牛胚胎体外生产环境的前提下，对水牛胚胎进行腺病毒感染，以生产出转基因胚胎为最终目标，提高转基因胚胎的生产效率。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，具体包括以下具体步骤：

(1)水牛卵母细胞体外培养：将屠宰场收集的水牛卵巢保存在39℃生理盐水中于1～2小时内送到实验室，去除卵巢系膜和输卵管多余组织，接着使用含双抗的生理盐水清洗，清洗后抽取直径为2～6mm的卵泡中的卵母细胞，然后选取胞质均匀、胞外有3层以上的颗粒细胞的水牛卵母细胞，洗涤后置于成熟培养液中于39℃、5％CO₂、饱和空气湿度的培养箱中培养；

(2)体外受精：将水牛冻精解冻后在爬高液内培养30min，

将于成熟培养液中培养22～24h后的水牛卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞吹打掉后，置于受精盘微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；

将爬高培养后的精子经过洗涤后加入上述受精盘微滴中，控制精子浓度1×10⁶个/mL～1.5×10⁶个/mL，将受精盘置于39℃、5％CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养；

(3)单层共培养系统的制备

将吹打掉的卵丘颗粒细胞吹打均匀后制成30μL/滴的微滴盘单层共培养系统，覆盖石蜡油，于39℃、5％CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养；