[发明专利]一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法

权利要求书

1.一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、试验设计

供试土壤为非石灰性潮土， 发育于冲积母质， 表土质地轻壤，有机质含量为4.10 g/kg， 全氮量为0.50 g/kg，全磷量为0.46 g/kg， 土壤有效磷为15 mg/kg，土壤速效钾为38mg/kg， 土壤阳离子代换量为11.80 cmol/kg；试验共设3个处理：对照组、低氮、高氮，每个处理设3次重复；试验地实行冬小麦—夏玉米轮作制，每年两作，夏玉米品种为鲁玉16，高量氮肥年施用量为276 kg/hm²，低量氮肥年施用量为138 kg/hm² ；

步骤2、测定项目与方法

2.1籽粒清蛋白的提取及测定

取 0.5g 样品加入 2mL 水，研磨至匀浆， 再加入 3mL 水转移至离心管中，用 3mL 水冲洗研钵并振荡5min，4500r/min 离心 8min，倒出上清液；加水 8mL，搅拌，振荡 5min， 离心，倒出上清液，共4次，合并倒出后的上清液；用水定容至 50mL；吸取上清液 1mL，加入考马斯亮蓝 5mL， 混匀，放置2min，595nm 比色；

2.2籽粒清蛋白的SDS- PAGE

电泳装置为 DYZC-24B 型电泳仪，板胶厚 1mm；分离胶浓度为 12%，浓缩胶浓度为 5%；将200µg 样品加入点样孔；开始时电压为 100 V，待溴酚兰完全进入浓缩胶界面后，换成120V 恒压电泳至结束；电泳后，用考马斯亮蓝染色，并脱色，扫描成像；

2.3籽粒清蛋白的纯化与定量

取上述籽粒清蛋白提取液用丙酮沉淀，12000 r/min离心1h，用裂解液溶解；用2-DClean-Up Kit纯化蛋白试剂盒纯化蛋白后，用水化液溶解蛋白；采用 Bradford法定量，以牛血清白蛋白为标准蛋白，所述的裂解液为：7 mol/L 尿素, 2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，40mmol/L DTT，0.2% IPG-Bufffer，pH 4~7；所述的水化液为：8 mol/L 尿素，2%CHAPS，20mmol/L DTT，0.5% IPG-Bufffer，pH 4~7；

2.4籽粒清蛋白的 2 -DE

取含 200 µg 蛋白质的上述籽粒蛋白质提取液，用上样水化缓冲液补充体积到 450µL后，将24 cm、pH 4~ 7的固相 pH 梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方，被动水化 17 h，然后进行等电聚焦：20℃，100V，1 h；300 V，1 h；500V，1 h；1000 V，2h；8000V，3h；8000 V，10h；聚焦结束后，分别用含1% DTT 和2.5%碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液平衡胶条各15 min；平衡完毕后，将胶条紧贴在 12%的聚丙烯酰胺凝胶上方，进行第二向电泳； 电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色，然后用UMAX Powerlook2100XL扫描仪扫描图像，所获图像用ImageMaster platinum6 分析软件进行分析，实验重复 3 次；通过分析，选取具有差异的差异蛋白点进行质谱鉴定；所述的上样水化缓冲液为水化液+0.002% 溴酚蓝+0.012% Destreak Reagent；

步骤3、数据处理

用DPS 9.50对数据进行统计分析，Microsoft Word 2003绘制表格。

2.根据权利要求1所述的长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，其特征在于，步骤2.4中，所述的2.5%碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液为6 mol/L 尿素，2%SDS，0.075 mol/L Tris-HCl pH 8.8，30%甘油，0.002％溴酚蓝。

3.根据权利要求1所述的长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，其特征在于，步骤2.4中，进行第二向电泳时，每根胶条3W，进行时间为24~27 h。