[发明专利]一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法

说明书

本发明公开了一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，通过蛋白质组学方法，研究长期定位施用高低氮肥对夏玉米鲁玉16籽粒清蛋白的影响。结果表明，对照组的清蛋白含量高于两处理组且在定量单向SDS‑PAGE中可以看出有明显的差异条带。双向电泳结果显示，长期低氮处理与对照组相比共有7个差异蛋白点，1个上调，6个下调；长期高氮处理与对照组相比共有6个差异蛋白点，1个上调，5个下调。通过质谱鉴定并对其进行功能分类，分别为蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白、能量代谢相关蛋白、表达调控及防御抗逆相关的蛋白、细胞代谢相关的蛋白及功能未知蛋白。

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法。

背景技术

随着人民生活水平的不断提高，对作物产品品质的要求愈来愈高，而农产品的品质与外界环境因素有直接的关系，如温度、光照、养分、水分和土壤等因素，肥料是现代农业生产中养分的主要供给源，直接参与协调营养代谢与循环，必然极大地制约着作物的产量与品质。近年来，氮肥对玉米籽粒蛋白的研究较多，这些研究大多是籽粒蛋白含量变化和相对短期的实验结果，并没有更深入的研究且对土壤肥力、肥力等没有延续性。玉米种子清蛋白是玉米4种主要蛋白质成分之一，遗传背景不同的玉米材料，通过电泳分析，将显示出不同的蛋白谱带，谱带的差异在一定程度上反映出基因型的差异，分析同一杂交种或自交系不同子粒的清蛋白谱带，可以看出个体间是否存在遗传上的分歧，从而便检验了纯度。利用蛋白质电泳技术鉴定玉米种子纯度的研究已有报道。但在长期定位施肥条件下的夏玉米籽粒清蛋白的蛋白组学研究尚属空白。

发明内容

为了弥补现有技术中的空白，本发明提出了一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，基于非石灰性潮土33年的长期定位施肥试验，研究长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白的影响，为科学施用氮肥和品质遗传改良提供科学依据。

其技术方案如下：

一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，包括以下步骤：

步骤1、试验设计

供试土壤为非石灰性潮土，发育于冲积母质，表土质地轻壤，有机质含量为4.10g/kg，全氮量为0.50g/kg，全磷量为0.46g/kg，土壤有效磷为15mg/kg，土壤速效钾为38mg/kg，土壤阳离子代换量为11.80cmol/kg。试验共设3个处理：对照组、低氮、高氮，每个处理设3次重复；试验地实行冬小麦—夏玉米轮作制，每年两作，夏玉米品种为鲁玉16，高量氮肥年施用量为276kg/hm²，低量氮肥年施用量为138kg/hm²。

步骤2、测定项目与方法

2.1籽粒清蛋白的提取及测定

取0.5g样品加入2ml水，研磨至匀浆，再加入3ml水转移至离心管中，用3ml水冲洗研钵并振荡5min，4500r/min离心8min，倒出上清液，加水8ml，搅拌，振荡5min，离心，合并上清液，共4次，用水定容至50ml。分别吸取各样液1ml，加入考马斯亮蓝5ml，混匀，放置2min，595nm比色。

2.2籽粒清蛋白的SDS-PAGE

电泳装置为DYZC-24B型电泳仪，板胶厚1mm。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。将200μg样品加入点样孔。开始时电压为100V，待溴酚兰完全进入浓缩胶界面后，换成120V恒压电泳至结束。电泳后，用考马斯亮蓝染色，并脱色，扫描成像。

2.3籽粒清蛋白的纯化与定量

取上述清蛋白提取液用丙酮沉淀，12000r/min离心1h，用裂解液溶解。用2-DClean-Up Kit纯化蛋白试剂盒纯化蛋白后，用水化液溶解蛋白。采用Bradford法定量，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

2.4籽粒清蛋白的2-DE