[发明专利]蓝舌病病毒基因型分型鉴别的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种BTV‑2型、3型、4型、7型、12型基因型分型鉴别的多重RT‑PCR试剂盒及其检测方法，用于单管同时鉴别检测蓝舌病病毒2型、3型、4型、7型、12型。本方法根据蓝舌病不同基因型病毒VP2基因序列保守区设计了5对PCR特异性引物，利用GeXP原理合成一对非生物来源的通用引物，在各对特异性引物的上下游分别添加通用引物构成5对特异性嵌合引物，用特异性引物进行反转录，结合通用引物及特异性嵌合引物构建多重PCR。利用优化的多重PCR体系及条件，可单管同时鉴别检测BTV 2型、3型、4型、7型、12型等5种基因型中的一种或多种，对BTV其它型及PPRV、FMDV核酸无特异性扩增，最低检测浓度可达到pg级。本发明建立的方法灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果。

技术领域

本发明属于分子生物学检测方法及检测试剂领域，PCR技术领域。具体而言，具体涉及蓝舌病病毒(BTV)2型、3型、4型、7型、12型多重RT-PCR 检测用试剂盒及方法。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属成员蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的，以昆虫为传播媒介的反刍动物的一种非接触性传染病，分布广泛，除南极洲外的各个大洲都发生蓝舌病的报道。BTV能感染大多数反刍动物，以绵羊最易感，且表现典型的临床症状，牛及山羊多为隐性感染,没有明显症状，但可长期带毒，野生动物及骆驼也可感染该病。由于病羊发病死亡，或即使不死，但其生产性能严重下降(如产肉产奶量下降，胎儿畸形、羊毛破坏、羔羊发育不良等)，造成巨大的经济损失，且严重影响国际贸易，OIE将其列为法定通报疫病，我国将其列为一类动物传染病。BTV血清型众多，已经被证实的有27个，分别以BTV1-27命名，各血清型之间交叉保护性低，混合感染的情况也时常出现，故对病毒分型亦很有必要。目前适用的检测方法主要有病毒分离培养、琼脂糖免疫扩散试验、血清中和试验(VNT)、ELISA、抗原捕获ELISA、RT-PCR、qRT-PCR及基因芯片技术。除VNT外均不能对病毒分型，而VNT虽能分型，但耗时长，成本过高，且对用于检测的血清质量要求高，不适合常规检测。国内外学者对病毒的分型做了相关研究，但只能单管对一型病毒分型，单管高通量对多型病毒分型的方法还未见报道。亚洲、非洲、美国、澳大利亚均已发现有BTV-2/3/4/7/12五种血清型的存在且BTV-2型/4型/7 型发生较频繁，欧洲及中东已存在BTV-2/4/12型，且都曾发生流行。这五种血清型在我国也已全部被发现，其中BTV-2/3/4/12型在1997年前就已被发现，且 BTV-4型、12型在所检测的毒株中不在少数，BTV-7也于2014年被分离到我国与世界各国有牛羊及其产品贸易，对蓝舌病的检测非常重要，以预防病毒传入或传出。多重PCR是一种利用多条特异性引物在同一PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性好和敏感性高等有点。传统多重PCR常常会存在引物之间相互竞争大而限制其通量和灵敏度的问题， Gexp-PCR用通用引物及上下游5’端分别带有通用引物上下游的特异性嵌合引物来进行PCR扩增，在扩增时，通用引物结合在特异性嵌合引物的两端，前几轮由低浓度的特异性嵌合引物主导扩增，后面由高浓度的通用引物主导扩增，可以减小各特异引物间的竞争，增加单管PCR的检测通量和检测灵敏度。借鉴 Gexp-PCR通用引物原理，但不像其在通用引物上添加荧光染料，使PCR产物不需要在专门的Gexp-PCR中才能分析，能在其它低成本仪器上分析，这样的多重PCR既能增加单管检测通量及灵敏度，又能减少成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的多重RT-PCR试剂盒和检测方法方法用于同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)2 型、3型、4型、7型、12型。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：BTV-2型、3型、4型、7型、 12型在同一RT-PCR反应体系中进行特异性扩增。

BTV-2型、3型、4型、7型、12型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒，包括各型反转录引物管、Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。

所述各型反转录引物管：