[发明专利]一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法

权利要求书

1.一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，包括如下步骤，

1）、从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；

2）、将表达外源重编程因子的微环游离型载体导入步骤1）中获取的红细胞祖细胞；

3）、将步骤2）中获取的含有表达外源重编程因子的微环游离型载体红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；

4）、待完全诱导后，更换步骤3）中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得外源重编程因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为iPSC；

所述微环游离型载体的制备方法包括如下步骤，

S1、用微环DNA亲本质粒转化宿主菌，该宿主菌内含有表达单向位点特异性重组酶的基因，该微环DNA亲本质粒中包含用于诱导红细胞祖细胞成为多能干细胞的外源重编程因子；

S2、诱导S1中宿主菌内单向位点特异性重组酶的表达；

S3、使S1中的微环DNA亲本质粒与S2中的单向位点特异性重组酶接触，发生位点特异性重组产生微环游离型载体；

所述外源重编程因子选自蝾螈OCT4转录因子和其他转录因子，其他转录因子选自NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53 knockdown、MIR302/367 cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意几种的组合。

2.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，单向位点特异性重组酶及其作用位点选自Cre重组酶/LoxP、Flp重组酶/FRT、ФC31整合酶/attB和attP中任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述的单向位点特异性重组酶是ФC31整合酶，其整合酶作用的重组位点为attB和attP。

4.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环游离型载体包括依次连接的DNA复制启动子以及作用于该DNA复制启动子的反式作用因子、转录调控元件、重编程因子编码序列和polyA加尾信号。

5.根据权利要求4所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述DNA复制启动子来源于EB病毒、Kaposi's肉瘤疱疹病毒、松鼠猴疱疹病毒、马立克式病毒的oriP。

6.根据权利要求4所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述反式作用因子为一种EBV nuclear antigen 1。

7.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述人类血液细胞来源于人外周血、脐带血和骨髓血中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述步骤1）中的扩增培养基、步骤3）中的多能干细胞诱导培养基和步骤4）中的多能干细胞培养基均为化学成分明确的培养基。

9.根据权利要求1所述的一种微环游离型载体高效重编程血液细胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微环DNA亲本质粒还含有细菌序列。