[发明专利]一种高纯度rhNGF的制备方法

说明书

一种从CHO细胞培养物中得到高纯度rhNGF的方法。结合了阳离子交换层析和疏水作用层析方法，其特征是，在两种方法层析前，分别进行增加了清洗步骤。实验证实，经过本发明方法的纯化，不仅能够清除rhNGF前体分子变异体，而且纯化产物中的N端截短及异常变异体含量大幅降低，产品纯度高，能满足临床使用要求。

技术领域：

本发明涉及一种高纯度rhNGF的制备方法，特别涉及一种从CHO细胞培养物中得到高纯度rhNGF的方法。

背景技术：

基因工程表达并在宿主细胞中产生的rhNGF中通常含有多种杂质，包括宿主细胞的蛋白质、核酸，还有表达产物rhNGF的变异体，诸如前体、N端截短及异常等；另外，还会存在内毒素、病毒污染物和细胞培养基成分等各种有机和无机成分的杂质。其中，N端截短及异常变异体与前体是影响重组人神经生长因子质量最关键的杂质，必须加以清除。

以上这些杂质的理化性质各不相同，最有效的清除方法也各不相同。

目前，对rhNGF进行纯化的报道有：

专利CN102702341A采用阳离子交换及分子筛(Superdex 75)两步方法制备了纯度大于98％的rhNGF，虽然猜测分子筛(Superdex 75)用以清除前体变异体，但该专利并未提及，且分子筛要求样品高度浓缩，上样量只能在柱体积1％-4％之间，树脂本身也较贵，规模化工业生产中不太适用。

专利CN1268639C采用高效阳离子交换以线性梯度洗脱方式分离rhNGF氧化、异构、脱酰胺等变异体，采用疏水作用层析(优选苯基)用以去除前体，但该方法均采用了线性梯度的洗脱方式。

专利CN106478801A采用阳离子交换及疏水层析(优选苯基)两步方法制备的纯度大于99％的rhNGF，该方法疏水作用层析同样采用了线性梯度的洗脱方式。线性梯度洗脱方式通常需要双泵层析系统，对设备要求较高，不利于大规模工业生产。

以上这些方法均未涉及清除N端截短及异常变异体，及采用阶段动态清洗方式清除前体变异体，且层析步骤采用线性梯度的洗脱方式，不利于大规模工业放大。

现有技术的每种层析方法虽然都能够除去rhNGF中一部分相关杂质，但使用单一方法都不能满意地去除所有主要杂质。比如，阳离子交换层析主要用于清除N端截短及异常变异体，疏水作用层析主要用于清除前体变异体。

因此，有必要研究不同方法的联合使用，才能得到高纯度的rhNGF。

发明内容

本发明的目的是结合不同手段，提供一种从CHO细胞培养物中得到高纯度rhNGF的方法。

本发明采用依次进行阳离子交换层析和疏水作用层析两种层析方法，可以得到高纯度rhNGF。其中，阳离子交换层析主要用于清除N端截短及异常变异体，疏水作用层析主要用于清除前体变异体。

关于疏水作用层析

本发明分析了rhNGF及其前体的理化性质。由于NGF前体中含有糖基化修饰，而成熟rhNGF不含糖基化修饰。前体由于存在糖链，比成熟rhNGF疏水性更弱。本发明利用该性质，使用疏水作用层析分离前体与成熟rhNGF，并使用疏水作用层析进行阶段清洗以清除前体变异体。而且本发明采用动态清洗的方式，提高了纯化rhNGF的效率。

关于阳离子交换层析

阳离子交换层析的目的是清除重组人神经生长因子中N端截短及异常变异体。

N端截短及异常变异体是影响重组人神经生长因子质量最关键的杂质，必须加以清除。