[发明专利]一种乳铁蛋白的液相色谱质谱检测方法在审
| 申请号： | 201810254892.6 | 申请日： | 2018-03-27 |
| 公开（公告）号： | CN108398503A | 公开（公告）日： | 2018-08-14 |
| 发明（设计）人： | 白沙沙;崔亚娟;赵玥;石明杨 | 申请（专利权）人： | 北京市营养源研究所 |
| 主分类号： | G01N30/02 | 分类号： | G01N30/02 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 100069 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 乳铁蛋白 肽段 液相色谱质谱 标准工作液 待测样品 标准品 酶解 高效液相色谱 胰蛋白酶酶解 牛乳铁蛋白 外标法定量 质谱检测 供试液 热变性 变性 试液 配制 检测 | ||
1.一种乳铁蛋白的液相色谱质谱测定方法，其特征在于，包括：将待测样品和乳铁蛋白标准品分别进行胰蛋白酶酶解处理，制成含特异肽段的待测样品供试液、含特异肽段的乳铁蛋白标准工作液处理试液；以特异肽段标准品配制特异肽段标准工作液；进行高效液相色谱质谱检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异肽段的氨基酸序列为VDSALYLGSR。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含特异肽段的待测样品供试液、含特异肽段的乳铁蛋白标准工作液处理试液的制备方法包括：将待测样品、乳铁蛋白标准品分别依次用碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺处理，然后再在氯化钙存在的条件下用胰蛋白酶酶解处理。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含特异肽段的待测样品供试液的制备方法包括：将待测样品制成样品溶液，加入碳酸氢铵或其溶液，混匀，加入二硫苏糖醇或其溶液，于40-60℃恒温反应30-60min，冷却；加入碘代乙酰胺或其溶液，暗处静止30-40min，加入氯化钙或其溶液和胰蛋白酶或其溶液，酶解完全，加入甲酸，室温静止30-60min，最后加水定容，混匀后过0.22μm滤膜，即可；
优选地，所述含特异肽段的待测样品供试液的制备方法包括：将待测样品制成总蛋白浓度或固形物浓度为2-10g/100mL的样品溶液，吸取100-300μL样品溶液，加入150-200μL浓度为500mmol/L的碳酸氢铵溶液，混匀，加入10-20μL浓度为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30-60min，取出冷却，加入40-50μL浓度为500mmol/L的碘代乙酰胺溶液，暗处静止30-40min，加入10μL浓度为100mmol/L的氯化钙溶液和30-60μL浓度为100μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解4-6小时，取出后加入10-20μL甲酸，室温静止30-60min，最后加水，使酶解液总体积为1.0mL，混匀后过0.22μm滤膜，即可。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述含特异肽段的乳铁蛋白标准工作液处理试液的制备方法包括：取适量乳铁蛋白标准品，配制成一系列浓度的标准工作液；吸取100-300μL该标准工作液，加入150-200μL浓度为500mmol/L的碳酸氢铵溶液，混匀，加入10-20μL浓度为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30-60min，取出冷却，加入40-50μL浓度为500mmol/L的碘代乙酰胺溶液，暗处静止30-40min，加入10μL浓度为100mmol/L的氯化钙溶液和30-60μL浓度为100μg/mL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解4-6小时，取出后加入10-20μL甲酸，室温静止30-60min，最后加水，使酶解液总体积为1.0mL，混匀后过0.22μm滤膜，即可。
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