[发明专利]一种乳铁蛋白的液相色谱质谱检测方法

说明书

本发明涉及一种乳铁蛋白的液相色谱质谱测定方法，包括：将待测样品和乳铁蛋白标准品分别进行胰蛋白酶酶解处理，制成含特异肽段的待测样品供试液、含特异肽段的乳铁蛋白标准工作液处理试液；以特异肽段标准品配制特异肽段标准工作液；进行高效液相色谱质谱检测。本发明以特异肽段外标法定量、乳铁蛋白标准同时酶解控制酶解系数，能够测定样品中非变性和热变性牛乳铁蛋白的含量。

技术领域

本发明涉及乳铁蛋白的测定方法，属于乳品检测技术领域。

背景技术

乳铁蛋白是一种天然的、具有免疫功能的糖蛋白，由转铁蛋白转变而来，晶体呈红色，大约由700个氨基酸残基构成，其分子量为80ku，等电点为8.7，可与铁可逆性结合，主要存在于乳汁中，同时在泪液、唾液、血浆、胆汁、胰液和嗜中性粒细胞中也有存在。乳铁蛋白在人初乳中含量较高，浓度为6～8mg/mL；奶牛初乳中浓度为1～2mg/mL，而在常乳中含量较低，人常乳中浓度为1～2mg/mL，奶牛常乳中浓度为0.02～0.35mg/mL。不同哺乳阶段乳汁中乳铁蛋白含量不断变化。

乳铁蛋白属于先天免疫系统的活性物质，也被作为一种功效成分-活性蛋白质，在我国，乳铁蛋白起步相对来说较晚，且其作用主要体现在抑菌方面，但除此之外，乳铁蛋白还具有杀菌作用，铁结合能力以及对铁吸收的促进作用和抗辐射作用等。乳铁蛋白作为功能性成分，已经被应用到很多领域，诸如食品、医药、口腔医学等方面。

截至目前，国内外还没有颁布乳铁蛋白的标准测定方法。乳铁蛋白的定性和定量检测方法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)以及反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等。ELISA方法是检测特定蛋白的有效方法，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。结合SDS-PAGE，可用于针对特定抗原的定性和定量检测。实践中常利用此种方法检测生鲜乳及乳制品中的乳铁蛋白含量。

酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)可分为测定抗体的间接法、测定抗原的双抗夹心法及竞争法3种。样品中乳铁蛋白含量的检测一般采用双抗体夹心法。ELISA法测定乳铁蛋白的含量具有快速准确、检测用于常乳、初乳、乳粉、奶酪等乳制品中乳铁蛋白的检测。但是此法也有一定的缺陷，在测定样品前需对样品进行多次稀释，且该法所用试剂盒较为昂贵。

十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl suate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)是一种常见的用于纯化和定性分析蛋白质的生物分析方法，有关其定量检测乳铁蛋白的应用已有所报道。利用电泳法分离乳铁蛋白具有设备简单、费用低廉、操作方法简单等优点，但它也存在一些缺点，如耗时长、不宜检测大批量样品、定量检测乳铁蛋白过程较为复杂等。

反相高效液相色谱法(reversed phase highperformance liquidchromatography，RP-HPLC)在国内外有关乳铁蛋白测定方法的研究中，既有关于利用正相高效液相色谱法测定乳铁蛋白的报道，也有采用RP-HPLC法测定乳铁蛋白的相关报道，目前采用RP-HPLC法较为常见，关于液相色谱法测定条件的优化已经存在很多研究。

随机免疫扩散法(random immune diffusion，RID)即抗原、抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散，两者在比例适当处相遇，发生沉淀反应。反应的沉淀物因其颗粒较大，在凝胶中不再扩散，形成沉淀带，沉淀带的直径与乳铁蛋白的浓度呈正比，用染色液将沉淀带染色，准确测量出环的直径，通过标准曲线图计算出试验样品中乳铁蛋白的浓度。

分光光度法是通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。用分光光度法测定乳铁蛋白浓度对仪器设备的要求较低，可以快速地测定乳铁蛋白的含量，适用于工厂中分离纯化过程中的快速检测或者对检测结果准确度要求不高的样品的分析，但其准确性比较差。

有鉴于此，特提出本发明。