[发明专利]一种砂壳虫的分离与培养技术

说明书

本发明建立了一项砂壳虫的分离与培养技术，属于微生物学领域。本发明的主要特征是能够从自然水体中分离纯化出砂壳虫单个虫体，进行室内传代培养。本发明通过室内培养获得大量的砂壳虫个体，克服了砂壳虫获取在时间和空间上的限制，为深入系统的研究砂壳虫提供了丰富的实验材料。本方法简单、高效、成本低、应用范围广。

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体为砂壳虫(Difflugia)的分离与培养技术，能够从自然水体中分离纯化出砂壳虫单个虫体，进行传代培养。

背景技术

有壳虫(testate amoebae)是一类常见的自由生活单细胞真核生物，具有个体小、丰度高、多样性高的特点，在陆地和水生生态系统物质循环和能量流动中起重要作用，对于维持生态平衡具有积极意义。砂壳虫(Difflugia)是有壳虫类群种类最多的一个属。作为单细胞生物，砂壳虫不仅是研究遗传和进化的优良材料而且对环境生态变化反应敏感，能够指示气候、水文等生态因子的变化。近年来，随着对砂壳虫深入研究，建立一种砂壳虫有效的分离与培养技术对进一步发现其价值和应用前景尤为重要。

目前，国内外仍缺少完整规范的砂壳虫分离与培养技术，由于砂壳虫对其生长环境存在一些独特的需求，甚至只在高温季节繁殖，使用常规培养技术对从野外分离个体进行室内纯化培养，一般很难成功。因此，研发一种简单有效、易操作的砂壳虫分离与培养技术是非常有必要的。该技术克服了砂壳虫获取在时间和空间上的限制，为系统深入研究砂壳虫提供了丰富的材料。

发明内容

本发明的目的是建立一种完整规范的砂壳虫分离与培养的技术，通过单细胞分离和室内培养获得大量的砂壳虫个体。

本发明可适用于砂壳虫属种类，且可广泛应用于不同的水体类型，包括河流、湖泊和水库等生境。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：砂壳虫样品的野外采集、过滤富集、单细胞分离、传代培养、物种鉴定。

本发明所述的技术方法具体包括如下步骤：

1)砂壳虫的野外采集与富集：使用25#浮游生物网(一般为64μm孔径，可根据虫体的大小选择浮游生物网的孔径)在水体表层进行拖网10min，至少30-40次。每4-5次拖网收集一份富集样品，转移到无菌瓶中临时储存，并在4h内运回实验室。

2)虫体的分离、纯化：将富集的砂壳虫放入培养皿或凹玻片上，使用微吸管或移液枪(1-10μL)在倒置显微镜或解剖镜下对砂壳虫进行逐个挑取，放入超纯水中浸泡5min左右、冲洗3-4次。

3)虫体的饥饿处理：将分离纯化的砂壳虫虫体放入装有超纯水的培养皿中，室温条件下饥饿2-3天。

4)单细胞培养：将饥饿处理后的砂壳虫虫体转移到预先添加IWS培养基的24孔板(无菌板)中，每个培养孔中接入单个虫体，并使用斜生栅藻喂食，在25-30℃的恒温光照培养箱中进行培养(光照周期，12:12h；光照强度，2000Lx)，一般7-10天转移一次虫体或者更换一次培养基。每日定期观测砂壳虫生长状况。

IWS培养基的组成：使用孔径0.2μm滤膜过滤的原位水(In situ water)；120℃高温高压灭菌的沙粒(Sterile sand)(直径64μm,密度为1×10^5-7ind/L)；以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus，密度为1×10⁸ind/L)喂食；原位水：沙粒：栅藻体积比为，40:2:1。

5)砂壳虫的形态学鉴定：利用倒置显微镜对砂壳虫的形态和运动特征进行观察，包括壳体和壳口的形态、大小以及细胞核和伪足的形态。

权利要求书

本发明主要的优势是：使用IWS培养基可从自然水体中分离出活的砂壳虫，并在室内实现传代培养。