[发明专利]一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用在审
| 申请号： | 201810257388.1 | 申请日： | 2018-03-27 |
| 公开（公告）号： | CN108441516A | 公开（公告）日： | 2018-08-24 |
| 发明（设计）人： | 杨蕊菊;孙子豪;杨兴林;潘讴东 | 申请（专利权）人： | 和元生物技术（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/66 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 201321 上海市浦东*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 慢病毒 目的基因 双启动子 载体构建 筛选 双启动子载体 慢病毒载体 表达系统 病毒包装 基础载体 抗性基因 片段替换 稳定细胞 荧光观察 启动子 构建 转染 应用 改造 驱动 细胞 感染 成功 研究 | ||
1.一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用，所述慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR扩增得到tCBh片段(序列如SEQ ID No. 3所示)替换pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro(序列如SEQ ID No. 4所示)载体中PGK得到。
2.构建如权利要求1 所述的慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro，其特征在于，所述载体的碱基序列如SEQ ID No.5 所示。
3.构建如权利要求1 所述的慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro，其特征在于，所述载体结构如图1所示。
4.构建如权利要求1 所述的慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体的方法，所述方法包括：
(1) 片段tCBh的扩增：以Addgene采购的 Multiplex CRISPR/Cas9 Assembly SystemKitprotocol 中的pX330A-1x2 质粒. (所述载体结构如图2所示)为模板，设计特异性引物扩增获得；所述扩增片段 tCBh的引物序列如下：
tCBh-F: 5'- ACGAGCTGTACAAG
tCBh-R: 5'-TGCTCACCATGGTAAGCTTGGGCT
(2)慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro的构建：用XbaI 和BspMI酶切载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro(所述载体结构如图3所示)，回收大片段后和tCBh片段进行无缝克隆。
5.如权利要求1 所述的CMV-CBh双启动子慢病毒表达载体在慢病毒载体构建中的应用。
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