[发明专利]一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用

说明书

本发明涉及一种慢病毒CMV‑CBh双启动子改造载体构建及应用。所述慢病毒载体pLenti‑CMV‑3FLAG‑EGFP‑tCBh‑mCherry‑T2A‑Puro由PCR扩增得到tCBh片段替换pLenti‑CMV‑3FLAG‑EGFP‑PGK‑mCherry‑T2A‑Puro载体中PGK得到。tCBh启动子驱动表达mCherry基因和Puromycin抗性基因，可以使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞；mCherry基因有助于判断病毒包装效率以及感染效率，同时也有助于稳定细胞的筛选。通过转染荧光观察，证明该慢病毒双启动子载体表达系统构建成功，为进一步研究感兴趣的目的基因提供基础载体。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用。

背景技术

双向启动子：位于两个相邻且转录方向相反的基因之间的一段DNA序列。

双向启动子在真核生物基因组中广泛分布，大多数的双向启动子缺少TATA盒，而具有较高的GC含量和丰富的CpG岛.双向启动子双向起始转录，且会对其双向转录的基因在共表达和稳定性表达调控中发挥一定的作用。

在对生物进行转基因改良的过程中，可能需要将不止一个的外源基因转入到特定的生物体内，这些外源基因需要在各自相应的启动子序列的调控下进行表达.由于用于遗传改良的启动子数量有限，所以在将多个基因转入生物体内时经常重复地使用一个特定的启动子或序列相近的启动子.这样虽然可以实现同时转入多个基因的愿望，但这种载体的构建费时费力.另一方面，因为引入的启动子序列同源，即使两个启动子之间只有90bp的序列同源，导入生物体内就会引起基因表达“共抑制”现象，导致基因转录的沉默，这是在转基因技术中所要面临的困难和挑战.

由于双向启动子能够在两个方向上指导mRNA的生成，这样在利用双向启动子进行转基因时，可以在其两端融合某生理或生化过程的两个基因或多个基因及其组合.这不仅避免了不同基因引入时的繁琐步骤，减少了引入受体生物中的启动子数目，更不必担心引入生物体内的启动子之间序列同源而导致的转基因沉默现例子并不多，并且子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子子进行转基因研究的重点仍然放在双向启动子的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程的应用为解决转基因技术难题提供了可能，在基因工程研究和应用领域具有不可估量的作用，正成为转基因技术研究的新领域。

发明内容

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

1.本发明的内容是构建共用增强子反向双启动子慢病毒表达载体

2.本发明采用的技术方案是：

一种慢病毒CMV-CBh双启动子改造载体构建及应用。所述慢病毒载体pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR扩增得到tCBh片段替换pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro载体中PGK得到。

3.本发明还涉及构建所述的慢病毒载体的方法，所述方法包括：

(1)片段tCBh的扩增：以质粒pX330A-1x2为模板，设计特异性引物扩增获得。

所述扩增片段tCBh的引物序列如下：

tCBh-F:5'-ACGAGCTGTACAAGTCTAGATAATCGAGGTGAGCCCCACGT-3'

tCBh-R:5'-TGCTCACCATGGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCCAACCTGAAAAAAAGTGATTTC-3'