[发明专利]一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法

权利要求书

1.一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）接种培养：将用于生产重组人凝血因子IX活性分子的细胞株接种于培养基中，发酵培养；

（2）补料发酵：发酵72-96小时后，调节并维持培养液中钙离子浓度至1 mM -3 mM，镁离子浓度至0.5 mM -2 mM；并补加培养基，继续发酵；

（3）当发酵至细胞活率低于70%，终止培养；

步骤（1）中，所述的培养基包括CDM4PERMAb培养基、ActiPro培养基、CDM4MAb培养基或CD OptiCHO培养基；

步骤（2）中，所述的补加的培养基中还含有Cell Boost 2；含有Cell Boost 2的培养基中的Cell Boost 2的含量不高于1.2%；

步骤（2）中，所述的调节并维持培养液中钙离子与镁离子浓度比为1-4：1-3；

步骤（2）中，所述的补加培养基的频率为每12小时或者24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的10%-40%；

步骤（2）中，所述补料发酵过程中还包括维持葡萄糖浓度在4 g/L-8 g/L之间。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组人凝血因子IX活性分子包括重组人凝血因子IX或长效重组人凝血因子IX；所述的长效重组人凝血因子IX包括重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白、重组人凝血因子IX-白蛋白融合蛋白、PEG修饰的重组人凝血因子IX。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的细胞株包括CHO细胞株、HEK293细胞株；所述的CHO细胞株为重组人凝血因子IX CHO DG44细胞株、长效重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白CHO DG44细胞株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的细胞株按10-100万/ml细胞密度接种于含5-10μg/ml维生素K1的培养基中，37.0℃，5.0%二氧化碳，100 rpm转速培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养方法为将生产重组人凝血因子IX的CHO DG44细胞株按50-80万/ml细胞密度接种于培养基中。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的发酵时间为72小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浓度比为4:3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的补加培养基的频率为每12小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的10%-20%；或所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次时，补加的培养基的体积为起始培养体积的20%-40%。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：所述的补加培养基的频率为每24小时补加一次，补加的培养基的体积为起始培养体积的30%。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的葡萄糖浓度为5 g/L。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖的补料方式是：每12小时或者24小时补加一次，每次补加至葡萄糖浓度为4 g/L-8 g/L之间。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：每次补加至葡萄糖浓度为5 g/L。