[发明专利]一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法

说明书

本发明公开了一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，它包括如下步骤：(1)接种培养：将用于生产重组人凝血因子IX活性分子的细胞株接种于培养基中，发酵培养；(2)补料发酵：发酵72‑96小时后，调节培养液中钙、镁离子浓度；并补加培养基，继续发酵；(3)当发酵至细胞活率低于70％，终止培养。本发明采用一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，对补料培养工艺进行了优化，通过控制发酵过程中钙离子与镁离子的浓度比例、补料液中Cell Boost 2的含量、葡萄糖的浓度、补料频率等因素，有效的提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法。

背景技术

人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)是一种糖蛋白，属于维生素K依赖性凝血因子，在血液中以丝氨酸蛋白酶的形式存在，在内源性凝血途径中起着重要的作用。人凝血因子IX在人肝脏中合成，并经过多种翻译后修饰才能成为成熟蛋白，包括糖基化、信号肽和前导肽的切除、N末端GLA区域的维生素K依赖性的γ-羧基化等。人凝血因子IX缺乏或者功能异常会导致出血性疾病血友病B的发生。血友病B在男性中的发病率为1/30000，而在女性中则非常罕见。血友病B临床主要靠定期输新鲜血浆或人凝血IX因子浓缩剂进行治疗。

补料批次培养是大规模产业化细胞培养中使用最广泛的一种培养，然而，在补料批次培养中细胞在经历对数生长期、平台期后会进入衰退期，期间细胞密度、细胞活率急剧下降，大大影响重组蛋白产量。为解决上述问题，需要对培养工艺进行优化，目前，优化方法主要包括使用半乳糖或果糖替代葡萄糖作为细胞培养的碳源，可以有效减少细胞培养过程中乳酸的产生和积累，改善细胞的后期生长状况；在无血清培养基中添加丙氨酰谷氨酰胺作为碳源可以提高细胞表达量，降低细胞凋亡率；或是利用基因工程手段抑制乳酸过量产生。

然而，目前重组人凝血因子IX活性分子及其衍生物的产量并不高，例如Kim等人通过对培养工艺优化，凝血因子IX的最高的产量为1.33IU/mL(Effect of Ca²⁺and Mg²⁺concentration in culture medium on the activation of recombinant factor IXproduced in Chinese hamster ovary cells，Journal of Biotechnology，2009，142，275-278)。因此，现有的培养工艺优化方法并不能实现较高的重组人凝血因子IX的产率，如何对培养工艺进行优化以提高产量一直是生物医药企业迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种重组人凝血因子IX活性分子的补料发酵方法，该方法对补料培养工艺进行了优化，显著提高了重组人凝血因子IX活性分子的产量。

本发明中，术语“分批补料”就是在发酵过程中，随着营养物质消耗，按照一定的时间间隔分批补入营养物质以达到维持代谢的目的。

本发明中，所述的CDM4PERMAb培养基、ActiPro培养基、CDM4Mab培养基购买于HYCLONE公司；CD OptiCHO培养基购买于GIBCO公司。

Cell Boost 2为HYCLONE公司的一款商业化的补料试剂，主要成分为氨基酸，维生素和葡萄糖。

重组人凝血因子IX-Fc融合蛋白为一种融合蛋白，它包括重组人凝血因子IX蛋白和Fc蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。

重组人凝血因子IX-白蛋白融合蛋白为一种融合蛋白，它包括重组人凝血因子IX蛋白和白蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。

PEG修饰的重组人凝血因子IX包括一个位点或多个位点带有官能团PEG修饰的重组人凝血因子IX蛋白，用于患有B型血友病的成人及儿童患者。