[发明专利]一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法

权利要求书

1.一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，其中正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示。

2.权利要求1所述引物对的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

A.通过NCBI网站，查询目标产物序列，设计引物对P，对目标产物进行PCR扩增；

B.将扩增产物进行序列测定，获得测试序列；

C.将测试序列与目标产物进行BLAST比对，确定序列相似性；

D.设计若干引物对P’扩增测试序列；

E.将扩增产物进行溶解曲线测试，筛选有特异性扩增峰，且无其他非特异性杂峰的引物对进行后续试验；

F.将扩增产物进行扩增曲线及在不同退火温度下的Ct值测试，筛选出其中的Ct均值最低的引物对进行后续试验；

G.将筛选出的引物对P’进行标准品线性测试，筛选线性结果优的引物对；

其中所述步骤G包括如下步骤：

(1)将目标产物标准品稀释若干个浓度点；

(2)利用筛选得到的引物对目标产物标准品不同浓度点进行扩增，建立标准曲线及计算扩增效率；

(3)筛选符合标准曲线R²≥0.98，且扩增效率(E)在90％～110％的浓度线性范围为10000pg/2μL～0.01pg/2μL的引物对P’。

3.一种利用权利要求1所述引物对定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的检测方法，其特征在于，利用所述引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测生物制品中残留CHO细胞DNA的含量；其中荧光定量PCR是通过荧光染料，对PCR产物进行标记跟踪，计算待测样品模板的初始浓度。

4.根据权利要求3的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR反应体系为总体积25μL，其中，2×浓度的荧光预混试剂12.5μL，正向引物F,10μM/μL 1μL，反向引物R，10μM/μL 1μL，H₂0 8.5μL，DNA模板2μL。

5.根据权利要求3的检测方法，其特征在于，PCR检测的反应条件为：①预变性：95℃30sec；②荧光收集：95℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，扩增40个循环，每个循环结束后收集荧光信号；③溶解曲线分析：65℃逐步升至95℃，每隔0.5sec升高0.5℃，收集荧光信号。