[发明专利]一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法

说明书

本发明涉及一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法，本发明利用特异性引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测生物制品中残留CHO细胞DNA。荧光定量PCR是通过荧光染料，对PCR产物进行标记跟踪，并计算待测样品模板的初始浓度，其中，所述特异性引物对，正向引物序列见SEQ ID NO:15，反向引物序列见SEQ ID NO:16。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测CHO细胞(ChineseHamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)DNA残留量的引物对及检测方法。

背景技术

CHO细胞为1957年美国科罗拉多大学Dr.Theodore T.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面仍将持续并且其所占比例有逐年增大趋势。CHO细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。

目前，生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的CHO细胞表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残留宿主细胞CHO细胞的DNA片段。生物制品中宿主细胞残留DNA片段可能携带病毒或致癌基因，具有潜在致瘤和传染风险，因此各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。对于宿主细胞DNA残留量必须满足世界卫生组织(WHO)、欧洲药典、美国食品与药品管理局(FDA)及其他管理机构所制定的指导纲要。在重组药物质量标准中一般均对宿主细胞DNA残留量有具体规定，如每一人用剂量的DNA残留量不得高于100pg。在生产纯化制备过程中，DNA残留的检测就成为重要的控制要素。

注射用重组人尿激酶原(Pro-UK)采用的宿主细胞为CHO细胞，因此该产品的生产过程中也存在宿主细胞残留DNA片段的问题。

目前，国外对于宿主细胞DNA残留量的检测，一般采用定量PCR(quantitativePCR，Q-PCR)技术、SYBRgreen染料法或探针标记法。国内检测一般采用《中国药典》(三部)2010版附录IXB“外源性DNA残留量测定法”收录的2种方法—“DNA探针杂交法”和“荧光染色法”，但现有方法的检测灵敏度低，消耗的原液样品量大，操作时间长，且此方法是半定量检测法，依肉眼判定结果，仅能判定DNA量是否小于100pg，而无法确切获得DNA含量的具体水平值。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物制品中CHO细胞DNA残留的检测方法，所述方法包括采用一种新的引物对。

本发明在于利用本发明的新的引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测生物制品中残留CHO细胞DNA的方法。荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

其中所述引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，其中设计引物的原则为：

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。