[发明专利]一种降香种子超低温保存方法

说明书

本发明公开了一种降香种子超低温保存方法。具体方法步骤为：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5～8℃处理20～30min，降温至0℃～‑2℃，降温速度为5～10℃/h，再降温至‑5℃～‑8℃，保持温度0.5～1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。本发明的降香超低温保存方法工艺简单，稳定性可靠，保存后的降香种子发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，试验结果表明超低温保存后降香种子发芽率高达95.72％。本发明能有效的、长期安全的保存降香种子，是降香种质资源长期保存的一种实用新方法。

技术领域

本发明涉及种质资源保存技术领域，具体涉及一种降香种子超低温保存方法。

背景技术

自1973年Nag等首次成功地将液氮超低温保存技术运用在胡萝卜悬浮培养细胞上以来，超低温保存技术已成功保存了近300种植物材料。大多数的植物材料在超低温环境中，其细胞的新陈代谢活动都会基本停止，从而使细胞的活力和形态发生的能力能够得到稳定保存。液氮冷冻主要是对植物材料存活率和生理生化指标有影响，从理论上讲，经过液氮处理后再生的植物材料不会发生遗传变异。但是植物材料在超低温保存过程中，除液氮冷冻外，还涉及到预培养、脱水、解冻和恢复培养等，这些过程会给植物材料造成胁迫，增加植物材料的氧化损伤，伤害到植物细胞，从而影响植物材料的再生，并可能对再生植株的遗传稳定性造成一定影响。所以在对植物材料进行超低温长期储藏前，应对超低温冷冻的几个步骤进行优化。

超低温保存植物材料不止是为了获得高存活率，也是为了得到安全、稳定、保真的再生植株，因此对超低温储藏后的遗传稳定性进行研究是非常有必要的。植物材料表型特征评估可能是检测超低温储藏对植株稳定性影响的最简单的方法。大部分研究表明，超低温保存后的材料在形态学方面没有明显的变化。在对超低温保存后的山药种质、橡胶愈伤组织、栓皮栎胚的再生植株中没有发现形态变化，但超低温处理后的杭菊再生苗早期营养生长指标均低于对照。多数研究证明，超低温保存前、后材料的基因组没有发生遗传稳定变异。在对超低温保存前后的五叶草莓、留兰香、人参、杭菊、君迁子等植物种质材料进行基因组遗传稳定性检测时，没有发现基因组改变现象；但在冷杉、木瓜等植物种质材料中却发现其基因组改变的现象。

降香(Dalbergia odoriferaT.Chen)是我国特有濒危药用植物，其种子属于顽拗性种子，我们实验室对降香的种子进行了液氮超低温保存，发现适宜含水量的种子超低温保存后均能发芽，但部分芽不能健康地成苗。推测是因为液氮超低温保存过程中的一系列胁迫对降香苗的生长造成了影响。本研究将优化降香种子的超低温保存步骤，以期获得稳定、保真的降香再生植株。

发明内容

本发明目的在于提供一种降香种子超低温保存方法。该方法能够弥补降香种质资源保存技术的不足，为降香种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。

本发明采取的技术方案如下：

一种降香种子超低温保存方法，包括以下步骤：室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5～8℃处理20～30min，降温至0℃～-2℃，降温速度为5～10℃/h，再降温至-5℃～-8℃，保持温度0.5～1h不变，然后迅速投入液氮进行超低温保存。

优选的，室温下将降香种子用装载液处理，取出后转入玻璃化保护剂中，5℃处理30min，降温至0℃，降温速度为5℃/h，然后再降温至-5℃，保持温度1h不变，之后迅速投入液氮进行超低温保存。

优选的，所述的装载液为：含有0.4-0.6mol·L^-1蔗糖及2-2.5mol·L^-1甘油的MS液体培养基，蒸汽灭菌15-20分钟，室温放置。