[发明专利]一种基于镉诱导H9-CMS细胞模型的心肌保护药物筛选方法

说明书

本发明提供了一种基于镉诱导H9‑CMS细胞模型的心肌保护药物筛选方法。针对人类心肌细胞的CIC尚未研究的现状，首先利用H9胚胎干细胞诱导培养心肌细胞，然后向心肌细胞同时添加待筛选药物和氯化镉；通过与仅添加氯化镉的对照组做对比，分析待筛选药物的性能。本发明表明，hPSC‑CMs的细胞模型可以在体外实验中验证CIC，本发明发现镉诱导后ROS升高，随后ROS的积累诱导下游信号一系列变化，导致心肌细胞活性降低、细胞凋亡和细胞功能障碍，本发明发现PI3K/Akt和p38MAPK信号通路在CIC中起重要作用，本发明的研究可以用来寻找新的心肌保护药物并研究其分子基础。

技术领域

本发明属于镉诱导心脏毒性的研究领域，具体涉及一种基于镉诱导H9-CMS细胞模型的心肌保护药物筛选方法。

背景技术

镉是一种普遍存在的有毒重金属，广泛的存在于工业污染物及环境中，对人类健康造成严重威胁，它在有毒物质和疾病的机构中名列第八。人类有多种途径可以接触到镉离子，包括接触工业污染物、摄入镉离子污染的食物和水、吸入含金属镉粉尘以及吸烟。当镉离子进入人体后体内没有可有效清除镉离子的生化机制，只有极少量的镉可通过尿液排泄，因此镉离子会随着时间的推移不断在体内积累。通常，镉离子在人体内的半衰期可达15-30年。

镉可损伤人体多种器官，其主要靶点包括肾、肺、肝、睾丸、骨骼和心血管系统。根据以往的研究表明镉会引起心血管疾病，如心肌梗死、外周动脉疾病、心肌病等疾病，高血压、动脉硬化、中风和心脏衰竭。目前镉诱导心脏毒性(CIC)主要研究了体外培养的小鼠的心肌细胞为细胞模型，然而动物模型与人类基因表达谱、电生理学的巨大差异，并不能准确地模拟人类心肌细胞的CIC。人类胚胎干细胞诱导的心肌细胞(HPSC CMS)提供了一个以人类生理基础，相关的和持续获得的细胞来源，从而进行疾病模型和药物筛选。一些以往研究已经证明HPSCCMS研究药物引起的心脏毒性的可靠性，这鼓励通过使用HPSC CMS模型来探讨CIC。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种基于镉诱导H9-CMS细胞模型的心肌保护药物筛选方法。

本发明的基于镉诱导H9-CM细胞模型的心肌保护药物筛选方法，包括如下步骤：

1)H9胚胎干细胞诱导获得心肌细胞

将H9胚胎干细胞进行培养，待H9细胞长到培养皿的80％以后，用1640-insulin培养基润洗一次，所述的1640-insulin培养基为1640培养基加B27minus Insulin；然后加入1640-insulin培养基，加入ChIR(AXON)使其浓度为6μM，过24小时以后在原有培养基上补充1640-insulin培养基(一半)；再过24小时换液，加入1640-insulin培养基；24h以后换液，然后加入1640-insulin培养基，加入IWR(MERCK)使其浓度为8μM，24h以后在原有培养基上加入补液，加入1640-insulin(一半)；后续两天每天换液，用1640-insulin培养基；最后经过24小时以后换液，加入1640+insulin培养基，所述的1640+insulin培养基为1640培养基(gibco)加B27Insulin；得到心肌细胞H9-CMS；

2)以同时添加待筛选药物和氯化镉为筛选组，以仅添加氯化镉为对照组，处理心肌细胞H9-CMS24小时，其中筛选组和对照组中氯化镉的浓度相同，所述的氯化镉的浓度范围为10μM-100μM；根据TUNEL染色和电生理结果评估待筛选药物。

优选的，所述的1640-insulin培养基中，B27minus Insulin占总培养液总量的2％。

优选的，所述的1640+insulin培养基中，B27Insulin占总培养液总量的2％。

优选的，所述的待筛选药物的添加浓度为其IC50值。