[发明专利]一种高效植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法

说明书

本发明公开了一种高效诱导植物受体孤雌生殖单倍体筛选方法。本发明同时将胚特异性启动子ZmESP驱动荧光蛋白eGFP和胚乳糊粉层特异性启动子HvASP启动荧光蛋白DsRED双标记表达盒构成胚‑胚乳双荧光标记载体。基于此胚‑胚乳组织特异性双荧光标记的玉米、水稻、小麦和大麦孤雌生殖单倍体诱导系，可实现精确高效大规模单倍体鉴定筛选，在单倍体育种中具有独特优势。利用本发明的方法可以克服胚及胚乳颜色或油份含量筛选标记因遗传背景对籽粒花青素表达或油份含量影响的限制，实现稳定、高效筛选单倍体籽粒。本发明可应用于任何遗传背景下、任何颜色与油份的材料，克服了现有技术对受体的限制，对于双单倍体育种有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种高效诱导植物受体孤雌生殖诱导与单倍体筛选方法。

背景技术

玉米是重要的粮食作物，也是当前杂种优势利用应用最为广泛的作物。玉米双单倍体(DH)育种技术是利用自然发生或人工方法诱导产生的单倍体，再通过自然或化学加倍获得二倍体纯合自交系。该方法实现了被选自交系一代纯合，与传统自交选育的需要6-7世代相比，具备明显的技术优势，正在成为选系的主要策略之一。DH育种技术主要包括三个环节，即单倍体的诱导、单倍体筛选、单倍体加倍。高效、准确筛选单倍体是关键的技术环节。目前，单倍体鉴定方法主要有形态学鉴定、细胞学鉴定、遗传标记鉴定等多种方法。

形态学鉴定：单倍体植株由于含有单倍染色体细胞，植株较矮，相当于二倍体的70％。叶片狭窄上冲，雄穗分枝、节间数、苞叶数、穗行数、等相当于二倍体90％。但不同出发材料表型差异巨大，该方法往往很不可靠，育种实践中无法采用。

细胞学鉴定：该方法主要依据单倍体和二倍体染色体数目的差异，于发芽时切取胚芽尖或根尖进行显微细胞遗传学鉴定，主要是染色体数目。该方法鉴定准确，但由于其操作复杂繁琐，需有技术有经验的技术人员大量取根部材料，往往单个植株的所有根尖取样后，也未必能成功鉴定。因操作复杂，技术难度大，耗时费力，且取样会导致植株存活，工作效率也远不到育种实践的需要。因此，世界范围内六十年以来的双单倍体育种实践中也没有成功研发基于细胞学鉴定的技术体系。

遗传标记法：利用单倍体诱导系材料自身携带的遗传标记基因的性状特点，进行单倍体筛选，减少了形态筛选产生的误差，是实用高效的筛选方法。

(1)R1-nj标记：Coe等(1964)将控制籽粒糊粉层和形成胚芽色素的R1-nj基因和控制不定根、叶鞘和茎秆色素形成的ABP1基因导入孤雌生殖诱导系Stock6，使之具有籽粒和植株双显性遗传标记。该R1-nj标记(Navajo标记)体系是基于r1基因位点的R1-nj等位基因的鉴别体系。籽粒上花青素沉积需要显性的结构基因如a1，a2，c2和花青素合成通路中的调控基因如c1，r1。在显性基因a1，a2，c1，c2存在时，R1-nj的表达将造成籽粒乳顶端的紫色花青素沉积。胚的盾片区域同样会有花青素的表达。大多数的单倍体诱导系在A1/A2/C1/C2/R1-nj基因位点都是纯合的。由于普通玉米r1基因为隐性，一般多为黄色或白色籽粒，故用该诱导系诱导产生籽粒后代分三种类型：胚和胚乳均带有R1-nj标记，为杂合二倍体；胚乳具R1-nj标记，为正常受精的三倍体，胚无R1-nj标记，为孤雌生殖单倍体；胚和胚乳均不带R1-nj标记，为外源源花粉污染。初步鉴定的单倍体再经田间种植鉴定，淘汰紫色植株，保留绿色的单倍体和或双单倍体。故诱导系与目标材料杂交，即可从籽粒颜色标记来区分单倍体籽粒和二倍体杂交籽粒。但籽粒Navajo标记遗传复杂，存在显性互补基因，修饰基因及基因剂量效应。籽粒着色程度还受气候条件及发育情况影响，且有些遗传背景中Navajo标记表现不明显。虽ABP1显性控制的紫色植株标记可在苗期进一步鉴定单倍体，但时间滞后且工序增加，加大人力物力成本。对母本材料籽粒自身有色的品种尤其一些籽粒有色特种玉米无效。该标记也不能应用机械识别来筛选突变体，需要大量人工靠肉眼挑选单倍体籽粒。