[发明专利]一种在线放大生产鸡传染性法氏囊病病毒的方法有效
申请号: | 201810267409.8 | 申请日: | 2018-03-28 |
公开(公告)号: | CN108277207B | 公开(公告)日: | 2020-09-08 |
发明(设计)人: | 李祖成;尹顺义;伍活镰;蒋东阳;任政华 | 申请(专利权)人: | 广州齐志生物工程设备有限公司 |
主分类号: | C12N7/00 | 分类号: | C12N7/00;C12N7/02;C12N5/071;C12N5/073;A61K39/12;A61P31/14 |
代理公司: | 广州科沃园专利代理有限公司 44416 | 代理人: | 张帅 |
地址: | 510530 广东省广州*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 在线 放大 生产 传染性 法氏囊病 病毒 方法 | ||
1.一种在线放大生产鸡传染性法氏囊病病毒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、种子细胞的制备:取贴壁细胞进行转瓶培养得到种子细胞,当细胞数量达到0.65-1.30×1010cells时进行三级在线放大培养;
S2、三级在线放大培养:取步骤S1所得种子细胞或单层细胞至生物反应器进行三级在线放大培养,添加微载体3-5g/L,培养液占生物反应器总体积65-75%,设置细胞贴壁参数为:DO:40-50、pH:7.2-7.3、温度:32-37℃、转速:30-100转/min、O2:0.2-0.4MPa/(L/min)/min、CO2:0.2-0 .6MPa/(L/min)/min、Air:0.2-0 .4MPa/(L/min)/min;3-4h后切换为细胞培养参数:DO:40-60、pH:7 .0-7 .5、温度:35-38℃、转速:30-80转/min、O2:0.2-0.4MPa/(L/min)/min、CO2:0.2-0.6MPa/(L/min)/min、Air:0.2-0.4MPa/(L/min)/min、灌流量为生物反应器总体积25-65%每天;
S3、病毒接种:当细胞密度为2.58-4.73×108cells/g微载体时,用PBS清洗载体,去除培养液和血清,将病毒液及清洗后的细胞液加入到含有无牛血清DMEM/F12培养液的罐体中,感染细胞,设置病毒吸附参数:DO:30-40、pH:7.40-7.80、温度:33-37℃、转速:30-50转/min、O2:0.2-0.3MPa/(L/min)/min、CO2:0.2-0.4MPa/(L/min)/min、Air:0.2-0.4Mpa/(L/min)/min;
S4、病毒培养与收获:病毒吸附1-2h后换成病毒培养参数,设置病毒培养参数:DO:30-50、pH:7.35-7.40、温度:33-37℃、转速:40-60转/min、O2:0.2-0.3MPa/(L/min)/min、CO2:0.2-0.4MPa/(L/min)/min、Air:0.2-0.4MPa/(L/min)/min,当出现70-85%细胞病变时收获病毒液;
步骤S2所述单层细胞需通过胰蛋白酶消化获得,所述胰蛋白酶消化步骤为:用灭菌PBS清洗载体,去除培养液和血清,调节pH为7.6-7.8,温度为35-37℃,添加胰蛋白酶0.01-0.025%,搅拌消化3-5min,加入生物反应器体积2-10%步骤S2所述培养液终止消化;步骤S2所述微载体为交联葡聚糖;
所述交联葡聚糖的制备方法为:
先用水使葡聚糖充分溶胀,加入固体NaOH和烯丙基-2 ,3-环氧丙醚,升温至50-60℃反应过夜,反应完毕后按水-乙醇-水依次洗涤,得活化葡聚糖微球;再将所得活化葡聚糖微球加入水和无水乙酸钠并充分搅拌,加入过量溴水反应10min,甲酸钠终止反应后继续搅拌30min,抽滤得葡聚糖凝胶;最后将0.1g/mL赖氨酸或聚赖氨酸溶液加入到所得葡聚糖凝胶中并调节pH为8.5-9.0,45℃反应24h,依次用pH为8.0的Tris缓冲液和pH为4.0的醋酸缓冲液分别浸洗5次,然后用0.9%NaCl溶液浸洗1次,丙酮脱水后在70℃的烘箱中彻底干燥,得交联葡聚糖;步骤S2所述生物反应器为无泡通气式生物反应器;
步骤S2所述的放大培养包括以下过程:
在线初级放大:取步骤S1所得种子细胞至7L生物反应器,添加微载体5g/L,培养液5L,设置细胞贴壁参数为:DO:50、pH:7.2、温度:37℃、转速:60转/min、O2:0.2MPa/(L/min)/min、CO2:0.2MPa/(L/min)/min、Air:0.2MPa/(L/min)/min;3h后切换为细胞培养,细胞培养参数为:DO:50、pH:7.3、温度:37℃、转速:60转/min、O2:0.2MPa/(L/min)/min、CO2:0.2MPa/(L/min)/min、Air:0.2MPa/(L/min)/min、灌流量3L/day;
在线二级放大:当细胞密度达到200cells/球时,用灭菌PBS清洗载体,去除培养液和血清,调节pH为7.7,温度37℃,加入0.02%胰蛋白酶,搅拌消化3min后加入2L培养液终止消化,得到单层细胞,在线将细胞输送到含有65g微载体的25L生物反应器中,补加培养液至18L,设置细胞贴壁参数;3h后设置为细胞培养参数,其中灌流量为15L/day;
在线三级放大:当细胞密度达到250cells/球时,用灭菌PBS清洗载体,去除培养液和血清,调节pH为7.7,温度37℃,加入0.02%胰蛋白酶,搅拌消化3min后加入5L培养液终止消化,得到单层细胞,在线将细胞输送到含有560g微载体的200L生物反应器中,补加培养液至125L,设置细胞贴壁参数;3h后设置为细胞培养参数,其中灌流量为75L/day;
所述步骤S3病毒的接种体积为培养总体积的0.001-0.1%。
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