[发明专利]一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用

权利要求书

1.真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA-Intron-Gdo在小麦全蚀菌龙胆酸加双氧酶基因（Gdo）RNAi效应分析中的应用，其特征在于，所述载体能够抑制全蚀病菌的生长发育；

所述的真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA-Intron-Gdo的构建方法包括以下步骤：

S1，去除pBHt2质粒的eGFP序列，构建pBHt2线性载体

S11，pBHt2-eGFP载体用BsrG1和SacI双酶切，切除9782-710bp位置的DNA片段，切除的DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示, 凝胶回收余下9072bp的酶切片段；

S12，人工合成一段如SEQ ID NO. 3所示的序列；

S13，人工合成的SEQ ID NO. 3所示片段用SacI酶切，凝胶回收75bp的SacI酶切片段；将9072bp的酶切片段与75bp的SacI酶切片段用T₄ DNA连接酶连接；连接后的质粒跑凝胶电泳回收，得到大小为9147bp的pBHt2线性载体；

S2，制备CHSA-Intron及两翼多克隆位点序列

pFGC5941质粒用NcoI和SmaI进行双酶切，其中NcoI酶切产生5’粘性末端，SmaI酶切产生平末端；凝胶回收1421 bp的CHSA-Intron线性片段；

S3，连接pBHt2线性载体与CHSA-Intron线性片段

将S13回收的pBHt2线性载体用NcoI酶切，然后与S2回收的CHSA-Intron线性片段用T₄DNA ligase连接；连接产物跑凝胶电泳，回收产物用连接酶进行平末端连接；连接产物跑胶纯化，回收重组质粒，即新载体候选质粒；新载体候选质粒经克隆鉴定，片段大小正确的为真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，如SEQ ID NO. 1所示；

S4，构建pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体

以全蚀病菌cDNA为模板，用引物PCR扩增出龙胆酸加双氧酶基因（Gdo）片段，所述引物序列如下：

5'引物序列：

5'-CAAACCATGGGGCGCGCCATGCTGGTGAACCCATCTCG-3'，如SEQ ID NO. 4所示，

3'引物序列：

5'-AAATTCTTACACATTTAAATAGGTAGGGCAGAGTGGCATA-3'，如SEQ ID NO. 5所示；

将所述干扰载体pBHt2-CHSA-Intron经过酶AscI和SwaI双酶切线性化后，通过无缝连接方法将Gdo片段连接到CHSA Intron的上游；然后用BamHI／XbaI双酶切载体，将Gdo片段反向连接，最终把Gdo序列相同的两段片段接入干扰载体pBHt2-CHSA-Intron上，构建出pBHt2-CHSA-Intron-Gdo载体。