[发明专利]一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用

说明书

本发明属于真菌RNA干涉载体构建技术领域，具体涉及一种真菌RNA干涉载体pBHt2‑CHSA Intron、构建方法及应用。所述载体pBHt2‑CHSA Intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该载体是在已有真菌表达载体pBHt2‑eGFP的基础上，引入了植物RNA干涉载体pFGC5941质粒的茶尔酮合成酶基因内含子序列CHSA Intron构建而成。新载体pBHt2‑CHSA Intron转化进真菌细胞内可产生靶基因的双链RNA结构，从而对靶基因转录形成的mRNA进行切割，导致靶基因沉默现象，能用于小麦全蚀病菌等真菌的基因沉默研究。

技术领域

本发明属于真菌RNA干涉载体构建技术领域，具体涉及一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用。

背景技术

RNA干涉(RNAi)是由特异双链RNA(dsRNA)引发的能序列特异性降解目的基因信使RNA(mRNA)的基因沉默机制，是基因的一种转录后沉默机制。对研究目的基因的功能和利用特定基因沉默来防治植物病虫害具有重要意义。真菌病害，如小麦白粉病，全蚀病，赤霉病等是许多植物最重要的病害，以RNA沉默为核心的寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)为防治真菌病害提供了崭新的途径。

RNA干涉载体是研究RNA干涉的重要工具，为方便真菌基因功能验证和寄主诱导基因沉默技术的应用。pBHt2-eGFP(闭合环状，总长9851bp,图1所示)含有真菌色氨酸合成操纵子中编码吲哚甘油磷酸合酶的基因(trpC)的启动子，是真菌最常用的转化载体之一，但不能转录形成双链RNA，不能用于真菌类RNA干涉研究。质粒pFGC5941(图2所示)启动子为花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S)，且含有茶尔酮合成酶基因内含子序列(CHSAIntron)，是常用的植物RNA干涉载体。但由于CaMV 35S启动子不能在真菌中表达，质粒pFGC5941不能用做真菌RNA干涉载体。基于上述原因，目前缺乏一种能够用于诱导小麦全蚀病菌等真菌基因沉默研究的载体。

发明内容

本发明提供的一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron、构建方法及应用，新载体pBHt2-CHSA Intron转化进真菌细胞内可产生靶基因的双链RNA结构，从而对靶基因转录形成的mRNA进行切割，导致靶基因沉默现象，能用于小麦全蚀病菌及其它真菌的基因沉默研究。

本发明的第一个目的是提供一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron，所述载体pBHt2-CHSA Intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种真菌RNA干涉载体pBHt2-CHSA Intron的构建方法，包括以下步骤：

S1，去除pBHt2质粒的eGFP序列，构建pBHt2线性载体

S11，pBHt2-eGFP载体用BsrG1和SacI双酶切，切除9782-710bp位置的DNA片段，切除的DNA片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,凝胶回收余下9072bp的酶切片段；

S12，人工合成一段如SEQ ID NO.3所示的序列；

S13，人工合成的SEQ ID NO.3所示片段用SacI酶切，凝胶回收75bp的SacI酶切片段；将9072bp的酶切片段与75bp的SacI酶切片段用T₄DNA连接酶连接；连接后的质粒跑凝胶电泳回收，得到大小为9147bp的pBHt2线性载体；

S2，制备CHSA-Intron及两翼多克隆位点序列

pFGC5941质粒用NcoI和SmaI进行双酶切，其中NcoI酶切产生5’粘性末端，SmaI酶切产生平末端；凝胶回收1421bp的CHSA-Intron线性片段；

S3，连接pBHt2线性载体与CHSA-Intron线性片段