[发明专利]一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法

权利要求书

1.一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2；

第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；

第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼；

Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2的构建包括：

体外直接合成9*GRE原件，序列SEQ ID No.3，将9*GRE原件酶切连接到pT2xex-GFP载体，9*GRE原件和pT2xex-GFP载体分别酶切反应如下：双蒸水：15微升；buffer：2微升；合成9*GRE原件序列：3微升；Xhol：0.2微升；BamH1：0.2微升；2.混匀，在水浴锅中37℃水浴1小时；

酶切结束后进行胶回收目的片段，然后进行连接反应；

连接反应如下：9*GRE原件酶切片段：6微升；连接酶buffer：2微升；酶切9*GRE原件载体：1微升；T4连接酶：1微升；PCR仪中，22℃1小时，16℃forever；

连接转化；

挑取正确克隆；

然后利用同源重组的技术将luciferase序列重组进入Tol2-9*GRE-HSV123-EGFP-SV40pA载体。

2.根据权利要求 1所述的糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：在第二步中，采用显微注射的方法。

3.根据权利要求 1所述的全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的引物序列为：

正向引物：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；

反向引物：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。