[发明专利]一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法

说明书

一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2‑9*GRE‑HSV.U123‑Luciferase‑SV40pA‑Tol2；第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼。本发明相对于其他方法检测糖皮质激素活性的方法来比较更容易定性和定量。

技术领域

本发明涉及一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，由于生活压力和环境变化的加快，抑郁病症也成为侵袭人类健康的重要疾病，据统计，在每个人生活中的或多或少的生命时间都会受到抑郁病的困扰。有些重型抑郁症患者可能最终走向自杀的极端来结束自己的生命。临床的研究发现几乎80%的抑郁症患者都发现糖皮质激素受体的表达降低的现象。糖皮质激素受体是生物体下丘脑-垂体-肾上腺主要的下游受体，通过绑定肾上腺分泌的糖皮质激素（皮质醇）来调节包括代谢、行为、生理等各种生物过程。所以，糖皮质激素作为研究抗抑郁病的过程中是一个非常有效的靶点。以前的细胞模型，由于作用比较单一，也不能反应整体的动物现象，无法评估药物的体内状况。传统的实验动物如小鼠，作为药物筛选的模型费用高，造模的时间长，并且无法实现高通量的药物筛选。

斑马鱼是一种热带硬骨鱼，由于和人类基因的高度同源性和诸多的优势作为生物医学研究的模式生物已经达到将近四十年的历史。并且研究发现斑马鱼的糖皮质激素受体和人的糖皮质激素受体结构，功能和作用的机制具有高度的类似。由此利用遗传操作技术，构建了一种糖皮质激素应答原件的转基因斑马鱼，由此我们构建了糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶基因转基因斑马鱼品系。此斑马鱼品系可用来进行糖皮籽激素受体作为靶点的抑郁类药物的高通量筛选和环境糖皮质类激素水质污染的监测，具有快速，直接和易量化的特征。

发明内容

本发明目的在于提供一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：

第一步：利用基因合成和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-9*GRE-HSV.U123-Luciferase-SV40pA-Tol2；

第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；

第三步：培育所述受精卵获得糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼。

优选的技术方案为：在第二步中，采用显微注射的方法。

优选的技术方案为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：

正向引物：GTGTCCGATTCAGTCATGCC；

反向引物：CTGGTTGTTTCTGTCAGGCC。

附图说明

附图1为载体图。

附图2为PCR电泳图。

附图3为地塞米松处理糖皮质激素应答原件驱动的荧光素酶转基因斑马鱼的荧光检测结果。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明的方法能够快速简便地检测糖皮质激素的活性和药物对下丘脑-垂体-肾上腺轴的紊乱。并且本发明不需要昂贵的仪器设备，灵敏度高，还能够反映个体的生理状况，最低可检测ng级别的糖皮质激素的浓度。本发明可应用于研究垂体-下丘脑-肾上腺轴相关的生物基础研究，药物对体-下丘脑-肾上腺轴的影响，以及环境中糖皮质激素的浓度测定。