[发明专利]一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法

说明书

一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2‑Crystallin启动子‑EGFP‑pA‑EF1α启动子‑GRcDNA‑pA‑Tol2；第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。本发明相对于其他方法来研究糖皮质激素受体的功能和以糖皮质激素受体为靶标的药物筛选提供便利。

技术领域

本发明涉及一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

下丘脑-垂体-肾上腺轴（The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA orHTPA axis）是生物体内能够通过反馈调节稳定集体的一个系统。下丘脑的室旁核的分泌可以促进抗利尿激素和促肾上腺皮质激素释放激素作用于垂体，刺激垂体分泌肾上腺皮质激素，然后作用于肾上腺皮质分泌糖皮质激素。糖皮质激素通过绑定糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）可以反馈作用于下丘脑和垂体（分别抑制CRH和ACTH的合成与分泌），形成反馈调节环路。HPA轴在包括免疫，压力应答等很多生理的稳态过程中起着重要的作用。临床的研究发现，几乎80%的抑郁症患者都发现糖皮质激素受体的表达降低的现象，并且青年期的不利因素会造成GR表达的异常，影响到成年后的情绪和精神疾病。所以研究GR的功能解析对于很多疾病的治疗提供新的思路。并且糖皮质激素受体作为研究抗抑郁病的过程中是一个非常有效的靶点。

斑马鱼是一种热带硬骨鱼，由于和人类基因的高度同源性和诸多的优势作为生物医学研究的模式生物已经达到将近四十年的历史。并且研究发现斑马鱼的糖皮质激素受体和人的糖皮质激素受体结构、功能和作用的机制具有高度的类似。由此利用遗传操作技术，构建了一种全身过量表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。此斑马鱼品系可用来进行糖皮质激素受体相关的功能研究，也为以糖皮质激素受体为靶点的药物筛选提供便利。

发明内容

本发明目的在于提供一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种全身糖皮质激素受体基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括下列步骤：

第一步：利用斑马鱼基因克隆和酶切连接的方法构建得到载体Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2；

第二步：将第一步得到的载体和Tol2 mRNA共注射到单细胞的斑马鱼受精卵中；

第三步：培育所述受精卵获得全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼。

优选的技术方案为：在第二步中，采用显微注射的方法。

优选的技术方案为：还包括提取F1代斑马鱼基因组，然后利用PCR方法对全身过表达糖皮质激素受体的转基因斑马鱼进行鉴定；所述PCR方法的的引物序列为：

正向引物：GGTGAACTTCAAGATCCGCC；

反向引物：CTTGTACAGCTCGTCCATGC。

优选的技术方案为：所述Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建包括Tol2-Crystallin启动子-EGFP-pA-Tol2载体的构建、Tol2-EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体的构建和利用同源重组的技术将Crystallin启动子-EGFP-pA片段重组进入Tol2- EF1α启动子-GRcDNA-pA-Tol2载体。

附图说明

附图1为载体图。

附图2为PCR电泳图。