[发明专利]含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用

说明书

本发明公开了含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。所述质粒载体含有CMV_Fny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因199bp的片段。该质粒载体与含野生型CMV_Fny RNA1和野生型CMV_FnyRNA3的质粒通过农杆菌浸润方法接种本氏烟，可显示弱致病症状以及不依赖仪器可裸眼判断其诱导基因沉默的能力；为弱毒疫苗的深入研究提供极大便利。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科2000多种植物。造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质。对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系统而防治后期侵染的强毒株系；是一种行之有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

CMV基因组由三条RNA(RNA1、RNA2和RNA3)组成，共编码5个蛋白。RNA1编码的1a蛋白是病毒复制酶重要组分。RNA2编码2a与2b蛋白，其中，2a蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性，与1a蛋白共同参与病毒的体内复制(Hampton，1992)；与2a蛋白存在编码序列部分重叠的2b蛋白由亚基因组RNA4A产生，是一种基因沉默抑制因子，能够最大限度地保护病毒基因组不被寄主植物降解(Csorba，2015)。RNA3编码3a蛋白(运动蛋白MP)和外壳蛋白CP；MP与病毒在寄主细胞间移动和长距离移动有关(Palukaitis，2003)，CP由亚基因组RNA4产生，与病毒粒体组装、蚜虫传播、病毒血清型及寄主症状表现有关(Palukaitis，1992；Edwardson，1991；Roossinck，2001；Chen，1990；Ding，1994)。由于CMV的2b蛋白是病毒编码的基因沉默抑制因子，对寄主植物对病毒基因组的基因沉默作用有很强的抑制作用，因此，在保持2a蛋白完整性的前提下，对2b蛋白的编码基因进行突变改造是构建CMV弱毒突变体的研究热点。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体及其应用。本发明针对2b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入烟草PDS基因片段，可形成裸眼可视型诱导基因沉默症状，为基于CMV的弱毒疫苗的深入研究提供了极大便利。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种含烟草PDS基因片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变型质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q，所述质粒载体含有CMV_Fny株系RNA2全序列，并在2a蛋白终止密码子后插入有烟草PDS基因片段；造成2b蛋白提前终止的同时尽可能保持了其他病毒核苷酸的潜在的顺式调控作用。

优选的，所述烟草PDS基因片段的长度199bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述质粒载体pCB301-CMV_Fny2-PDS₁₉₉-Q的制备方法，包括以下步骤：