[发明专利]一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法

权利要求书

1.一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用，其特征在于：该标记试剂结构以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团；

其中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。

2.根据权利要求1所述的荧光检测应用，其特征在于，所述开关型硫醇荧光标记试剂的化学名称为：N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺，其化学结构式为：

。

3.根据权利要求2所述的荧光检测应用，其特征在于，包括以下步骤：

a.配制磷酸盐缓冲溶液和五组不同浓度硫醇标准品的乙腈溶液，硫醇标准品溶液中硫醇标准品浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM和10mM；配制N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺荧光标记试剂的乙腈溶液；

b.分别按分组依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、硫醇标准品乙腈溶液和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到硫醇标准品色谱分离图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；

c.依次将体积比1:2:1的磷酸盐缓冲溶液、经柱纯化/膜过滤后的样品和标记试剂溶液混合，于40℃的水浴中反应10min；反应完成后，取10μL进入高效液相色谱仪中检测分析，设置荧光激发波长290nm，荧光发射波长368nm，得到样品色谱峰面积，代入得到的硫醇浓度工作曲线中，既得样品中所含硫醇的浓度。

4.根据权利要求3所述的荧光检测应用，其特征在于，在步骤a中，磷酸盐缓冲溶液的pH＝7.4、浓度为10mM，硫醇标准品乙腈溶液的浓度为100mM。

5.根据权利要求3所述的荧光检测应用，其特征在于，在步骤b中，各组硫醇标准品溶液为100μL，经柱纯化/膜过滤后的样品为100μL。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述荧光检测应用所采用的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于，将咔唑与4-溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；将中间体Ⅱ与马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，该合成方法具体包括以下步骤：

1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至25℃后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl水溶液混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；

2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；

3)酰化反应：将马来酸酐溶解到丙酮中，滴加溶有中间体Ⅱ的丙酮溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液溶剂蒸干，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到25℃后慢慢倒入水中，回收固体并干燥，用乙腈重结晶至少三次得目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。

8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤1)的所述取代反应中，咔唑与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。

9.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的30％。

10.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，在步骤3)的所述酰化反应中，9-((4-氨基)-苯基)-咔唑与马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的10％。