[发明专利]一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法

说明书

本发明属于荧光标记技术领域，提供一种开关型硫醇荧光标记试剂的荧光检测应用及其合成方法。该标记试剂结构以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团；其中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。本发明合成方法简便，易于实现，得到的开关型荧光标记试剂，标记反应速率快，无背景干扰，灵敏性高，合成方法简便。

技术领域

本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域，具体涉及一种开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法与应用。

背景技术

高效液相色谱分析技术(简称HPLC)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。然而，目前可应用的马来酰亚胺类荧光标记试剂数量有限，并且现有荧光标记试剂与硫醇加成产物荧光不明显，背景干扰率高，合成步骤复杂，其应用受到一定的限制，现有技术却并没有给出行之有效的完整解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种反应速率快、无背景干扰、灵敏性高、合成方法简便的开关型硫醇荧光标记试剂；本发明同时提供其具体合成方法与荧光检测应用。

本发明所提供的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团。在荧光检测应用中，该标记试剂通过咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，用于荧光检测样品中巯基化合物的含量。

所述开关型硫醇荧光标记试剂的化学名称为：N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺，其化学结构式为：

所提供的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，包括将咔唑与4-溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；将中间体Ⅱ与马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。

具体优选包括以下步骤：

1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至25℃后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；

2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收析出固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；

3)酰化反应：将马来酸酐溶解到丙酮中，滴加溶有中间体Ⅱ的丙酮溶液，于25℃反应1小时，反应结束后将反应液溶剂蒸干，回收固体并干燥；固体干燥后加入乙酸酐溶解，再加入无水乙酸钠，于85℃下反应1小时，待反应液冷却到25℃后慢慢倒入冰水中，回收固体并干燥，用乙腈重结晶至少三次得目标产物N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-马来酰亚胺。

进一步，在步骤1)的所述取代反应中，咔唑与4-溴乙酰苯胺摩尔比为1:1.5，碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾的加入量分别为咔唑质量的25％、22％和50％。

进一步，在步骤2)的所述水解反应中，氢氧化钾的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的30％。

进一步，在步骤3)的所述酰化反应中，9-((4-氨基)-苯基)-咔唑与马来酸酐的摩尔比为1:1.1，乙酸钠的加入量为9-((4-氨基)-苯基)-咔唑质量的10％。

本发明所提供的上述开关型硫醇荧光标记试剂的应用中，具体用于检测样品中硫醇的浓度，步骤为：