[发明专利]一种咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用

说明书

本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术领域，提供一种咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用。所述的稳定同位素标记试剂为N‑(4‑(咔唑‑9‑基)‑苯基)‑N‑[d₀]/[d₂]马来酰亚胺，其合成方法是将咔唑与4‑溴乙酰苯胺进行取代反应，得到中间体Ⅰ9‑((4‑乙酰氨基)‑苯基)‑咔唑，然后中间体Ⅰ在碱性条件下加热水解，得到中间体Ⅱ9‑((4‑氨基)‑苯基)‑咔唑；将中间体Ⅱ与[d₀]/[d₂]马来酸酐进行酰化缩合反应，生成目标产物N‑(4‑(咔唑‑9‑基)‑苯基)‑N‑[d₀]/[d₂]马来酰亚胺。本发明合成方法简便，易于实现，得到的稳定同位素氘代巯基化合物标记试剂，同位素标记位置稳定，能选择性地标记各类巯基化合物，具有标记产物产率高、标记反应速率快以及对巯基化合物选择性高等优点。

技术领域

本发明属于有机小分子稳定同位素标记技术应用领域，具体涉及一种咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂及其合成方法与应用。

背景技术

高效液相色谱-质谱串联技术(简称HPLC-MS/MS)由于其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于生命分析、环境检测、食品评估等研究领域。采用HPLC-MS/MS的选择反应监测(简称SRM)或多级反应离子监测(简称MRM)模式可以选择性的监测样品中的靶向分析物以及半靶向分析物。然而，由于样品中基质或者共洗脱物质引起的信号减弱或增强的基质效应的问题使HPLC-MS/MS的分析性能大打折扣，其应用受到一定的限制，现有技术却并没有给出行之有效的完整解决方案。

近年来，稳定的同位素编码技术受到了很大的关注，尤其是稳定同位素编码衍生技术，借助轻/重同位素编码衍生试剂，可获得具有相同官能团的同种分析物的同位素衍生物。其通常以重型同位素衍生物作为内标物进行HPLC-MS/MS定量分析。然而，迄今已有的化学标记方法都有诸多缺陷，如标记反应速率慢、标记产率低、标记产物信号弱、标记准确性和灵敏性较差等等，并且很多标记试剂的合成复杂，不易获得相应的同位素产物，因此限制了此类技术的广泛使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种标记反应速率快、标记产物信号高、质谱检测巯基化合物准确性强和灵敏性高且合成简便的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂；本发明同时提供其具体合成方法与应用。

本发明所提供的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂是以咔唑为母体环，马来酰亚胺为反应基团与同位素标记基团，其化学名称为：N-(4-(咔唑-9-基)-苯基)-N-[d₀]/[d₂]马来酰亚胺，其化学结构式为：

其中：当X＝H时，为N-(4-(咔唑-9-基)-)苯基)-N-[d₀]马来酰亚胺，简写为NCPM-[d₀]；当X＝D时，为N-(4-(咔唑-9-基)-)苯基)-N-[d₂]马来酰亚胺，简写为NCPM-[d₂]。在本发明中，H指氢的同位素氕，D指氢的同位素氘。

所提供的咔唑类稳定同位素巯基化合物标记试剂的合成方法，包括以下步骤：

1)取代反应：将咔唑和4-溴乙酰苯胺溶解到二甲亚砜中，并与碘化亚铜、二叔戊酰甲烷和碳酸钾混合，油浴130℃反应12h，反应结束待反应液冷却至室温后抽滤，得抽滤液，然后将抽滤液与(10-30)wt％的NaCl混合析出沉淀，回收沉淀固体并干燥，得到中间体Ⅰ9-((4-乙酰氨基)-苯基)-咔唑；

2)水解反应：将中间体Ⅰ溶解于溶有氢氧化钾水溶液的二甲亚砜溶液中，于100℃反应2小时，冷却后，将反应液与水混合，回收析出固体并干燥，用乙醇重结晶制得中间体Ⅱ9-((4-氨基)-苯基)-咔唑；