[发明专利]用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测产气荚膜梭菌的实时荧光RPA引物和探针组合，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明还公开了利用所述引物和探针组合快速检测产气荚膜梭菌的实时荧光RPA方法。本发明的引物和探针特异性强，仅对产气荚膜梭菌有特异性扩增曲线，而其它菌株均无扩增曲线，灵敏度高，检出限为1.0×10¹CFU/mL。本发明的实时荧光RPA方法，为样品中产气荚膜梭菌的快速现场检测提供了有效的技术手段，尤其适用于实验设备较为落后的基层检测实验室和疫情突发现场。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，C.perfringens)是一种革兰氏阳性厌氧菌，又称为魏氏梭菌(Clostridium welchii,C.welchii)，是一种人兽共患病病原体。目前至少已发现19种产气荚膜梭菌毒素，根据产气荚膜梭菌分泌的α、β、ε、ι四种主要毒素，可以将分为A、B、C、D和E型。不同型的产气荚膜梭菌可以导致不同的疾病，并都具有发病急、死亡率高等特点。产气荚膜梭菌广泛分布在土壤、污水等自然环境中。在我国由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件非常严重，摄入被产气荚膜梭菌污染的食物后，能够引起恶心、腹泻等临床症状，从而引发肌坏死性疾病；羔羊、仔猪、牛犊、雏鸡等动物感染产气荚膜梭菌，会导致坏死性肠炎、肠毒血症等疾病。产气荚膜梭菌的污染给人类的健康和畜牧业的发展造成了巨大的危害，因此对产气荚膜梭菌病的早期快速检测显得尤为重要。

目前，对产气荚膜梭菌的传统检测方法主要有分离培养、细胞素方法、卵磷脂水解试验和反向间接乳凝胶结试验等，上述方法检测周期长，过程费时费力。随着分子生物学技术的发展，孙佳芝等建立灵敏度为4.57ug/L的双抗夹心ELISA检测方法；鲍长磊等建立了产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法；石玉玲等根据16S rRNA基因建立了real-time PCR方法，灵敏性则为9×10²CFU/mL；刘哲等建立了特异性检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增方法(LAMP)，灵敏性为2.92×10²CFU/mL。ELISA方法检测灵敏性不高，试剂盒价格昂贵，且需要特异性设备；LAMP方法需要4-6条引物，设计复杂，且极易造成假阳性结果。因此，建立一种反应迅速、操作简便、灵敏性高的检测方法对于产气荚膜梭菌的有效控制依然具有重要意义。

聚合酶重组酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温扩增技术，主要依赖于重组酶、聚合链置换功能的DNA聚合酶、单链结合蛋白等三种核心酶实现对靶基因的等温扩增。在反应过程中，重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列。同源序列定位后，则会引发链置换反应，引物结合到对应模板上，具有链置换功能的DNA聚合酶进而从引物3'末端开始启动DNA合成，实现对靶基因的级数级扩增。RPA能够在37-42℃恒温条件下20min内完成检测，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域，目前已经被广泛应用于多种食源性致病菌的快速检测，但尚未见用于产气荚膜梭菌的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针，并提供其在建立快速实时荧光RPA检测产气荚膜梭菌方法中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针组合，其特征在于：

F引物序列如SEQ ID NO:1所示，R引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQID NO:3所示。

SEQ ID NO:1：5’-TAGTTGGGATGATTGGGATTATGCAGCAAAGGT-3’；