[发明专利]一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法

权利要求书

1.一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；

S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；

S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；

S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；

S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；

S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。

2.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S1中所述蛋白样品加入SDS上样缓冲液中混合后，100℃煮沸5min，使蛋白质氨基酸侧链与SDS充分结合。

3.根据权利要求2所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S1中开始电泳时设置恒压80V，待所述指示带跑入分离胶时，更换为130V恒定电压，直至所述指示带跑至凝胶底部，结束电泳。

4.根据权利要求3所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S2步骤中的所述PVDF膜在进行转膜前先置于甲醇溶液中激活2min，然后于转移缓冲液中平衡约5min。

5.根据权利要求4所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S2步骤中转印夹组装之前，先将PAGE胶、滤纸、海绵浸泡于转移缓冲液20min。

6.根据权利要求5所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S4步骤加入的所述一抗采用含有5％BSA的PBST进行稀释，稀释比例为1:5000。

7.根据权利要求6所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S5中所述的辣根过氧化物酶采用含有5％BSA的PBST提前稀释，所述抗兔二抗提前按照1:2000比例进行稀释。

8.根据权利要求7所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S6中显色的曝光时间为10min、60张。

9.根据权利要求7所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S6中所述显影剂为增强型化学发光(ECL)HRP底物。