[发明专利]一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法

说明书

本发明公开了一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法,包括步骤：S1、样品制备及凝胶电泳，在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合，电压80V进行电泳；S2、转膜，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭，将PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min；S4、加一抗，加入一抗，24℃摇床孵育2h，PBST漂洗4次，5min/次；S5、加二抗，加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，PBST漂洗4次，5min/次；S6、显色，将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，进行凝胶显影。本发明在磷酸化蛋白质的免疫印迹检测中采用湿转膜方式，蛋白信号连续且强度高；一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，蛋白信号效果较好。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法。

背景技术

目前恶性肿瘤的发病率越来越高，临床上主要依靠CT扫描进行病情筛查，这对于肿瘤组织较小的发病早期的筛查和诊断存在盲区。研究恶性肿瘤发生发展的分子机理，并进行分子层面的准确检测，对于及时预测和筛查早期病情意义非常重要。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要共价修饰方式之一，参与调节细胞的多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架条款、细胞凋亡、肿瘤发生等。如酪氨酸激酶和蛋白质酪氨酸磷酸化在肿瘤的发生和生长中起了重要作用。但由于生物体内磷酸化蛋白质的含量及磷酸化位点的化学计量值常常很低，大规模分析磷酸化蛋白质在技术上具有较大困难。目前关于磷酸化蛋白质组学的研究发展缓慢，相关的分析检测方法较少。如何从复杂的蛋白样晶中，或者其酶解产物中特异性地分离和富集磷酸化蛋白和磷酸化肽段，是磷酸化蛋白质组学研究中的一个巨大挑战和成功与否的关键所在。

Western Blot检测技术是将蛋白质样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体上，利用抗原抗体的特异性结合反应来检测目标蛋白的表达。Westren Blot中有半干转和湿转两种不同转膜方法，另外一个关键点是特异性抗体对特定抗原的有效识别抗体识别蛋白特异性位点的过程是一个抗原抗体反应，只有当抗原和抗体比例适当时才出现最大反应，因此需要为特定抗原量(即蛋白量)选择合适的一抗稀释比例。Western blot检测到步骤繁杂、变异因素较多，不同的目标蛋白种类、不同的转膜方法、不同的抗体稀释比例对蛋白质检测效果差异很大，因此研究磷酸化蛋白的Western blot检测方法具有重要的价值。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，检测结果灵敏可靠，蛋白信号强。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜(硝酸纤维素膜)，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，每层之间用玻璃棒去除气泡，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。