[发明专利]克隆酶供体免疫检测试剂、制备方法、检测系统、检测方法以及试剂盒

说明书

本发明公开了一种克隆酶供体免疫检测试剂，包括：底物和缓冲液，所述缓冲液的pH为2.0～8.5，所述底物能被克隆酶水解，所述克隆酶为β‑D‑半乳糖苷酶，所述底物为式(I)所示的β‑D‑半乳糖苷化合物。本发明还公开了克隆酶供体免疫检测试剂的制备方法、检测系统、检测方法以及试剂盒。本发明提供的克隆酶供体免疫检测试剂具有较高的灵敏度和较大的工作区间，底物性质稳定，能稳定存在于克隆酶供体免疫检测试剂中，可以直接以液体试剂的形式储存、销售，免去了制备冻干试剂的工艺步骤，也无需临时配置，大大降低了生产成本低，提高了使用的便利性。

技术领域

本发明涉及检测分析领域，具体涉及克隆酶供体免疫检测试剂、检测系统、制备方法、检测方法以及试剂盒。

背景技术

利用DNA重组技术制备β-D-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体(EnzymeAcceptor,EA),小片段称为酶供体(Enzyme Donor,ED)。其中所述ED是半乳糖苷酶近N端的片段，大小为30～70个氨基酸，相对于ED而言，EA是缺失相应序列的半乳糖苷酶，大小为940～980个氨基酸，其中，ED上具有可以与小分子抗原偶联的基团，从而可以对抗原进行ED标记，从而得到ED标记的抗原偶联物。分开的两个酶片段本身均无酶活性，但在合适条件下结合在一起就具有酶活性，可以水解β-D-半乳糖苷类化合物的糖苷键，生成α-D-半乳糖和对应的片段。利用这两个片段的特性建立的酶免疫检测法称之为克隆酶供体免疫检测法(Cloned Enzyme Donor Immunoassay,CEDIA)。具体地，如图1所示，CEDIA的检测原理是：样本中的抗原和ED标记的抗原与抗体特异性竞争结合形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原和抗体结合后，由于空间位阻，不能用于与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原和EA结合形成具有活性的β-D-半乳糖苷酶。加入底物测定酶的活力，酶活力的大小与样本中抗原浓度成正比，从而测定样本中抗原的浓度。CEDIA主要用于分子量小于1500的有机小分子抗原的检测，其中，有机小分子抗原包含小分子药物，例如地高辛。

目前，广泛用于克隆酶供体免疫检测法中的底物是氯酚红β-D-半乳糖苷(Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside,CPRG)。其优点是水解产物的摩尔吸光系数ε值高，能提供酶活力测定的良好工作区间，但是，CPRG在缓冲溶液中的稳定性非常不好，因此所有使用CPRG为底物的克隆酶供体免疫检测试剂都不能做成液体试剂，而不得不做成冻干试剂，这不仅增加了生产成本，而且使用极不便利，同时容易增加检测结果的误差。另一市场上可买到的酶底物是2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(2-nitorphenyl β-D-galactopyranoside,ONGP)。其优点是在缓冲溶液中的稳定性较好，但遗憾的是，其水解产物的摩尔吸光系数ε值很小，因而，使用ONPG做底物的检测试剂的工作区间很小，灵敏度低，误差较大，因此，市场上较少应用。

发明内容

为了解决以上克隆酶供体免疫检测试剂的不足，更好地满足市场需求，本发明的目的在于提供一种灵敏度高，既能提供有效工作区间且底物稳定的克隆酶供体免疫检测试剂。

为了实现上述目的，本发明提供了一种克隆酶供体免疫检测试剂，所述克隆酶供体免疫检测试剂用于测定待测样本中抗原的含量，所述待测样本中的抗原为分子量小于或等于1500的有机小分子化合物，其特征在于，所述克隆酶供体免疫检测试剂包括：底物和缓冲液，所述缓冲液的pH为2.0～8.5，所述底物能被克隆酶水解，所述克隆酶为β-D-半乳糖苷酶，所述底物为式(I)所示的β-D-半乳糖苷化合物：

其中Ar为苯基，所述苯基任选地被至少两个取代基取代，所述取代基选自氟、氯、溴、硝基、亚硝基、氰基、三氟甲基和酯基中至少一种或者多种。

可选地，所述底物溶解于所述缓冲溶液中，所述缓冲溶液的pH为2.0～7.0。

优选地，所述缓冲溶液的pH为3.0～6.5。