[发明专利]一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法

权利要求书

1.一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

A、选取特定蚕龄的家蚕喂食浓度为9％-11％的Fecl₃溶液，连续喂食2-4天后，剪破家蚕尾角，收集家蚕血液，收集管中加入少量的苯基硫脲，摇匀；

B、向步骤A收集的血液里加入蛋白裂解液，每100μL的血液加入0.8-1.2ml裂解液，充分混匀，得到混合样品液；

C、将步骤B得到的混合样品液，先液氮冻融，再超声破碎9-11分钟，然后在3-4℃的温度下,以11000-13000rpm的转速，离心分离14-16mins，取上清液；

D、将步骤C得到的上清液置于74-76℃的水浴中加热1.5-2.5小时，再在3-5℃温度下,以11000-13000rpm转速，离心分离14-16min，取上清液；

E、选择分子量为95-105kDa的Millipore蛋白超滤浓缩离心管，将步骤D所得的上清液进行浓缩，收集截流液，经验证该截流液为浓缩的家蚕铁蛋白粗提液；

F、步骤E获得的铁蛋白粗提液经Native-PAGE后切下黄色条带胶，以PAGE胶蛋白回收试剂盒回收即得家蚕铁蛋白，采用Bradford方法定量，测得铁蛋白浓度为5μg/μL。

2.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤A所述的特定蚕龄的家蚕是指5龄第1天家蚕。

3.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于，步骤A所述的给特定蚕龄的家蚕喂食Fecl₃溶液的具体方法为：选取5龄第1天家蚕连续喂食10％浓度的Fecl₃溶液，将Fecl₃溶液均匀涂在桑叶上，平均每头蚕5μL，连续喂食3天，每天喂食3次。

4.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤B所述的裂解液的成分为0.5M Tris-HCL(PH6.8),0.1％Triton X-100,1mM PMSF,0.2％FereneS。

5.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤E所述的浓缩的条件为4℃,12000rpm,离心2min。

6.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤E所述的验证方法为：将收集的截流液，经Native-PAGE电泳检测，未染色前可见黄色条带，验证该条带为铁蛋白的条带。

7.根据权利要求1所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤E所述的验证方法为：对分离提取的家蚕铁蛋白分别采用一维Native-PAGE以及SDS-PAGE结合LC-MS/MS分析进行蛋白验证，分析证明家蚕铁蛋白得到很好的分离提取。