[发明专利]一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，首先选取特定蚕龄的家蚕喂食一定浓度为的Fecl₃溶液，连续喂食2‑4天后，剪破家蚕尾角，收集家蚕血液，向其中加入少量的苯基硫脲，再加入蛋白裂解液，充分混匀后，进行液氮冻融，再超声波破碎，然后离心分离，取上清液，水浴加热，再离心分离，取上清液，用超滤管进行浓缩，收集截流液，经验证该截流液为浓缩的家蚕铁蛋白，进一步以PAGE胶回收的方法获得高浓度的铁蛋白。本发明方法成本低，材料来源丰富和提取工艺简单，为铁蛋白的获得提供了一种新途径。

技术领域

本发明涉及昆虫铁蛋白的分离技术领域，具体涉及一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法。

背景介绍

铁蛋白是一种普遍存在的铁结合蛋白，在铁的储存和运输过程中扮演着重要角色。铁蛋白由24个亚基组成的，这些亚基组合在一起形成4,3,2点对称的空心球体。昆虫铁蛋白由重链亚基(H链)和轻链亚基(L链)组成的球形蛋白复合体，其中H链含有保守的铁氧化酶活性，可以结合铁原子将Fe2+氧化为Fe3+。L链上虽没有铁氧化酶活性但其酸性氨基酸可以促进铁的水解和铁核的形成。利用铁蛋白的空腔结构构建纳米药物可以运用于纳米医学。目前主要通过利用FeS,CdS等生物合成铁蛋白，合成的难度较大，并且，合成的铁蛋白中的一些天然结构和功能往往有所改变。

本发明研究从家蚕的血液中提取分离铁蛋白,并通过实验鉴定了提取分离出的物质中含有铁蛋白复合体及其亚基，该方法成本低，材料来源丰富，且提取工艺简单，提取出的铁蛋白的天然结构和功能没有改变，提取出来的铁蛋白浓度高，浓度为5μg/μL。

发明内容

本发明提供一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，本提取方法成本低、效率高，能高效提取分离家蚕血液中的铁蛋白，且提取出来的铁蛋白浓度高，本方法提取纯化的铁蛋白有助于铁蛋白的运用和生物学研究。

本发明采用的技术方案如下：

一种从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

A、选取特定蚕龄的家蚕喂食浓度为9％-11％的Fecl₃溶液，连续喂食2-4天后，剪破家蚕尾角，收集家蚕血液，收集管中加入少量的苯基硫脲，摇匀；

B、向步骤A收集的血液里加入蛋白裂解液，每100μL的血液加入0.8-1.2ml裂解液，充分混匀，得到混合样品液；

C、将步骤B得到的混合样品液，先液氮冻融，再超声破碎9-11分钟，然后在3-4℃的温度下,以11000-13000rpm的转速，离心分离14-16mins，取上清液；

D、将步骤C得到的上清液置于74-76℃的水浴中加热1.5-2.5小时，再在3-5℃温度下,以11000-13000rpm转速，离心分离14-16min，取上清液；

E、选择分子量为95-105kDa的Millipore蛋白超滤浓缩离心管，将步骤D所得的上清液进行浓缩，收集截流液，经验证该截流液为浓缩的家蚕铁蛋白粗提液；

F、步骤E获得的铁蛋白粗提液经Native-PAGE后切下黄色条带胶，以PAGE胶蛋白回收试剂盒回收即得家蚕铁蛋白，采用Bradford方法定量，测得铁蛋白浓度为5μg/μL。

所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于：步骤A所述的特定蚕龄的家蚕是指5龄第1天家蚕。

所述的从家蚕血液中提取分离铁蛋白的方法，其特征在于，步骤A所述的给特定蚕龄的家蚕喂食Fecl₃溶液的具体方法为：选取5龄第1天家蚕连续喂食10％浓度的Fecl₃溶液，将Fecl₃溶液均匀涂在桑叶上，平均每头蚕5μL，连续喂食3天，每天喂食3次。