[发明专利]一种人血管性血友病因子（vWF）活性的定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种人血管性血友病因子(vWF)活性的定量检测试剂盒，所述试剂盒的定量范围是3.2mIU/ml～51.5mIU/ml，所述的试剂盒包括，

(1)人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板，

和(2)HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液：

所述的人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板的制备方法是：以微量滴定板做载体，用包被缓冲液稀释人Ⅲ型胶原至20μg/ml，按照100μl/孔的量包被微量滴定板，2～8℃包被过夜；

所述的HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液的制备方法是：用检测抗体稀释液将人抗vWF检测抗体稀释至0.5μg/ml。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述的包被缓冲液的配置方法为：称取0.795g Na₂CO₃,1.465gNaHCO₃溶于400ml注射用水中，用NaHCO₃调节pH至9.6±0.3，定容至500ml，用0.2μm滤器过滤，保存于2～8℃；优选的，调节所述的包被缓冲液的pH至9.5；

所述的检测抗体稀释液配制方法为：称取11.90gHEPES,2.92g NaCl溶于400ml注射用水中，添加0.5ml Tween-20混匀，用6％NaOH调节pH至7.2±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容至500ml，保存于2～8℃。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括：封闭液、样品稀释液、洗液、显色液、终止液；

所述的封闭液的配制方法为：称取4.0g NaCl,0.58g Na₂HPO₄,0.1g KH₂PO₄,0.1g KCl，溶于400ml注射用水中，用5mol/L NaOH调节pH至7.4±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容500ml；除菌过滤后保存于2～8℃；

所述的样品稀释液的配制方法为：称取11.90g HEPES，2.92g NaCl溶于400ml注射用水中，添加0.5ml Tween-20混匀，用5mol/L NaOH调节pH至7.2±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容至500ml；除菌过滤后保存于2～8℃；

所述的洗液的配制方法为：称取8.0g NaCl,1.15g Na₂HPO₄，200mg KH₂PO₄,200mg KCl和1.0ml Tween-20溶于900ml注射用水中，调节pH至7.4±0.2，除菌过滤后保存于2～8℃。

所述的终止液为：2mol/L的H₂SO₄。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体是多克隆抗体，优选为Anti-VWF/Von Willebrand Factor Antibody(HRP)，lifespan biosciences Inc.。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒的定量拟合方程为四参数Logistic拟合方程，优选的，所述的拟合方程为：Y＝(-0.707-5.28)/[1+(X/39.7)^0.58]+5.28

式中Y为检测450nm处的吸光度，X为vWF因子的活性(单位为mIU/ml)。

6.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒适用的样本的环境因素包括：

(1)氯化钠浓度：＜0.35mol/L、

(2)氯化钙浓度：≤125mmol/L、

(3)vWF/FⅧ活性比值＞0.1。

7.使用权利要求1-6任一所述的试剂盒检测vWF活性的方法，包括如下步骤：

(1)包被：用包被缓冲液(pH 9.5)稀释人Ⅲ型胶原至20μg/ml浓度后，按照100μl/孔包被微量滴定板，2～8℃包被过夜；

(2)封闭：洗板3次后，加入封闭液200μl/孔37℃水浴1小时，再洗板3次拍干备用；

(3)上样：取一支国际标准品用样品稀释液稀释至51.5-3.218mIU范围内，样品稀释液作为阴性对照，待检样品稀释至标准曲线范围内，按照100μl/孔加入微量滴定板，在37℃水浴1小时；

(4)检测抗体：洗板3次后加入检测抗体100μl/孔，在37℃水浴1小时；

(5)显色：洗板3次后拍干，加入TMB底物100μl/孔37℃水浴显色10分钟；

(6)终止反应：加入终止液50μl/孔终止反应；

(7)读数：终止反应后应在15分钟内在450nm处读取A_450nm值，并记录。