[发明专利]一种人血管性血友病因子（vWF）活性的定量检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种人血管性血友病因子(vWF)活性的定量检测试剂盒，所述检测试剂盒的定量范围是3.2mIU/ml～51.5mIU/ml，所述的检测试剂盒包括，(1)人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板，和(2)HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液：所述的人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板的制备方法是：以微量滴定板做载体，用包被缓冲液稀释人Ⅲ型胶原至20μg/ml，按照100μl/孔的量包被微量滴定板，2～8℃包被过夜；所述的HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液的制备方法是：用检测抗体稀释液将人抗vWF检测抗体稀释至0.5μg/ml。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种人血管性血友病因子(vWF)活性的定量检测试剂盒。

背景技术

血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)是由内皮细胞与巨大细胞合成的一种高分子量的糖蛋白，其在体内多以多聚体形式存在，分子量高达220kDa～2×10⁷kDa，其在人体中含量为7～10mg/L，在血浆中的活性含量为0.5～2IU/mL^[1]，vWF位于12号常染色体短臂末端，其cDNA编码2813个氨基酸组成的初级转录产物——vWF前体(pre-pro-vWF),该前体包含4个结构域，从N端到C端分别为D1一D2一D′一D3一A1一A2一A3一D4一B1一B2一B3一C1一C2一CK，其中D1，D2区域位于724个氨基酸编码的前肽中，当vWF初级产物在内皮细胞和巨大细胞中合成时，前肽断裂，形成2093个氨基酸构成的成熟vWF，转移至内质网中，单体的vWF相互通过C端的二硫键连接，形成二聚体，经过细胞糖基化修饰，多个二聚体相互连接，最终形成分子量高达2×10⁷kDa的糖蛋白^[2]。D′-D3区域是凝血FⅧ(凝血因子Ⅷ)结合位点，A1区域与血小板膜糖蛋白Ib结合，A3区域则与Ⅲ型胶原结合，当出现流血现象，其与受损的血管壁胶原结合，介导血小板黏附在受伤区域，启动血栓形成。

人体血管性血友病因子的数量和质量出现异常时会导致遗传性出血疾病——血管性血友病(von Willebrand Disease，VWD)，根据流行病学资料显示发病率高达1％^[3]，然而各种医疗机构的检测结果显示，更真实的患病率为0.05％。VWD的检出率低，误诊率很高，不仅因为我国血液疾病检查的普及度低，更因传统的瑞斯托霉素辅因子检测vWF活性(vWF:Rco)是一种半定量检测法，其检测方法灵敏度低，检测限高，对于体内vWF质量异常的Ⅱ型VWD患者，不能高效，灵敏的检测出其活性含量，严重影响患者诊断与治疗。

发明内容

基于上述问题，本发明旨在建立一种高效，高灵敏度的vWF活性检测方法并进行相关实验验证。

本发明涉及一种人血管性血友病因子(vWF)活性的定量检测试剂盒。

所述的试剂盒包括人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板和HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液：

所述的人Ⅲ型胶原包被的微量滴定板的制备方法是：

(1)以微量滴定板做载体，以人Ⅲ型胶原包被微量滴定板，

包被缓冲液(pH 9.5，0.015mol/L的Na₂CO₃,0.035mol/L的NaHCO₃)：称取0.795gNa₂CO₃,1.465gNaHCO₃溶于400ml注射用水中，用NaHCO₃调节pH至9.6±0.3，定容至500ml，用0.2μm滤器过滤，保存于2～8℃，优选的，所述包被缓冲液的pH值为9.5。

用包被缓冲液(pH 9.5)稀释人Ⅲ型胶原至20μg/ml，按照100μl/孔包被微量滴定板，2～8℃包被过夜。

所述的HRP酶标记的人抗vWF检测抗体指示液的制备方法是：