[发明专利]一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用，利用一种体内外靶向小鼠基因组NPL基因重组CRISPR敲除质粒载体，通过受精卵显微注射技术成功建立二倍体双敲NPL小鼠敲除模型。NPL在机体的病理生理过程中发挥着重要的作用，肿瘤细胞的恶性转化常常伴随着唾液酸的过表达，现如今已成为肿瘤的恶性转化及转移重要标志物之一。该模型为研究细胞癌变的过程研究搭建了新的研究平台，有利于研究肿瘤的生成及转移的关键步骤，同时为新型抗肿瘤药物的研发提供了基础。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，涉及分子生物学、细胞生物学和遗传学等研究方法，具体涉及一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

基因敲除小鼠模型的建立，为精准的研究基因与人类疾病作用关系创造了可能。自从转基因动物诞生以来，便得到了人们极大的重视，随着近年不断发展和完善，转基因动物已经逐渐开始在多个领域之中发挥着及其巨大的作用，对于整个社会来说，这些转基因动物极大的促进了社会经济和科学研究的发展。构建转基因动物模型，特别是基因敲除和敲入的动物模型是研究基因功能最直观可靠的途径之一，特别是为肿瘤的发生发展研究开辟了新的平台与方向。基因敲除小鼠构建的敲除方法发展至今，主要有ES细胞打靶技术、TALEN技术和Cre/loxP条件敲除等方法，随着CRISPR/Cas9技术的发展，因其具有的靶向性强、敲除效率高以及操作方便等优点，因而十分适用于目标基因敲除小鼠的制备。

显微注射技术，显微注射是较早发展用于将外源基因导入到细胞中构建转基因动物的方法之一，但是外源DNA片段如果通过非同源重组的方式整合进入宿主基因组，其整合随机性非常大且效率较低。使用CRISPR/Cas9技术与显微注射技术的结合，能够大大解决敲除小鼠制备周期过长的困扰，同时实现对受精卵和胚胎达到精确基因编辑的需要。

唾液酸与肿瘤发生及恶化有着极大的关系，研究表明，细胞的恶性转化常常伴随着唾液酸的过表达。有效构建一种稳定、NPL基因完全敲除的小鼠将大大有利于探索NPL基因及其相关通路在肿瘤粘附转移中达到的关键作用，促进NPL相关互作基因的研究发现，为肿瘤恶化转移的研究及相关药物筛选搭建了新的研究平台。

发明内容

本发明旨在提供一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用。包括在鼠源细胞验证有效的靶向NPL基因sgRNA重组敲除CRISPR质粒载体，通过显微注射重组靶向NPL基因CRISPR系统至受精卵，并回输输卵管得到新生小鼠，通过鼠尾测序验证NPL基因敲除阳性小鼠。

为了实现本发明的所述目的，采用以下实验技术方案：

选取可表达CRISPR/Cas9基因编辑系统的敲除质粒为Px459 vector，设计靶向NPL基因sgRNA，通过酶切连接得到重组Px459质粒。

如上述的重组ICAM-1敲除重组Px459质粒载体的构建方法，如下步骤：

1）根据NPL基因CDS区序列（Chromosome 1 - NC_000067.6），设计靶向NPL基因sgRNA，得到NPL-sgRNA，序列为GGTGTCCGCGGCGGAATCCG；

2）合成NPL-sgRNA正向及反向寡核苷酸序列，合成时在两端加上BbsI酶切位点；通过梯度退火形成双链寡核苷酸；

NPL-sgRNA正向及反向寡核苷酸序列为：

正链F:CACCGGGTGTCCGCGGCGGAATCCG ；

反链R:AAACCCGGATTCCGCCGCGGACACC；

3）将BbsI酶切后的Px459质粒载体回收，通过T4连接酶与双链NPL-gRNA连接形成重组基因敲除载体；转化感受态菌种单克隆挑取测序得到所需NPL-gRNA/Cas9重组敲除CRISPR载体，即重组Px459质粒。