[发明专利]一种肝素类药物生物效价的测定方法

说明书

本发明提供了一种肝素类药物生物效价的测定方法，属于生物分析领域。该测定方法包括：将凝血因子与待测药物、抗凝血酶III以及凝血因子所对应的特异性底物混合，构建体外抗凝血因子的效价体系；通过高效液相色谱‑质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量；以已知效价的肝素类药物为标准品，根据量反应平行线法计算待测药物的生物效价。该测定方法可以有效降低干扰，特异性强，且操作简便、节约时间，能够有效的提高测定效率。

技术领域

本发明涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种肝素类药物生物效价的测定方法。

背景技术

血液凝固由一系列连锁的复杂化学反应构成，这一系列连锁反应组成了凝血级联系统。目前公认的凝血因子，有12种，国际上统一按发现的顺序标记为罗马数字I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII。每一个连锁反应都是蛋白水解反应，会将一个酶原转化成相应的丝氨酸蛋白酶并最终生成凝血酶(FIIa，其中表示a表示凝血因子的活性形式)。抗凝剂大都是凝血级联反应中关键酶的抑制剂，在临床上用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。

目前应用最为广泛的抗凝血剂是肝素类药物，包括普通肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)。肝素类药物的抗凝血作用是通过抗凝血酶III(ATIII)来实现的。肝素类药物和ATIII的结合加速了对凝血级联反应中凝血因子Ea(E＝II、VII、IX、X、XI、XII)等多种关键蛋白酶的抑制，其中凝血因子IIa(FIIa)和凝血因子Xa(FXa)对其抑制作用最敏感。高负电荷密度的肝素类药物能与ATIII上带正电的赖氨酸结合，使ATIII的分子结构发生变化，暴露出活性部位的精氨酸，从而大大增加了ATIII与凝血因子中丝氨酸接触的概率，可使ATIII的抗凝血活性增强1000倍左右。

生物效价的测定是肝素类药物质量控制的1个重要生物学指标，能反映肝素类药物的抗凝活性。传统的肝素类药物生物效价测定包括：凝血法(活化部分凝血活酶时间(APTT)和活化凝血时间(ACT))、免疫印迹法、显色法(紫外和荧光法测定)。凝血法易受实验室、试剂、仪器设备等条件变化的影响，重现性差，并且灵敏度低，通常只能得到半定量的结果；免疫印迹法是基于与几种独特的抗肝素抗体的反应建立的方法，应用受到限制。对于显色法：现行中国药典(ChP2015)使用的紫外分光光度法所需要的试剂量较大且价格昂贵，测试成本较高，且会受到样品基质的干扰。荧光法具有特异性强，灵敏度高的优势，但荧光底物的背景荧光会对检测产生较明显的干扰。另外，荧光法测定使用人血浆作为酶源，以此建立酶的反应体系，容易受到血浆个体差异的干扰，且人血浆的提供和保存也有苛刻的条件限制。

鉴于此，本发明提供一种新的肝素类药物生物效价的测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝素类药物生物效价的测定方法，其通过构建体外抗凝血因子的效价体系，利用高效液相色谱-质谱联用分析系统进行定量测定，反应体系微小、灵敏度高、特异性强，且能避免复杂生物样品中的物质对测定结果的干扰。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种肝素类药物生物效价的测定方法，其包括：

将凝血因子与待测药物、抗凝血酶III以及凝血因子所对应的特异性底物混合，构建体外抗凝血因子的效价体系；

通过高效液相色谱-质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量；

以已知效价的肝素类药物为标准品，根据量反应平行线法计算待测药物的生物效价。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种肝素类药物生物效价的测定方法，通过构建体外抗凝血因子的效价体系，避免直接使用生物样品进行测定，且通过利用高效液相色谱-质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量，以此来衡量效价体系中的凝血因子的反应活性；再通过与标准品进行比对，即可得到待测药物的生物效价。