[发明专利]一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法

权利要求书

1.一种2,5-呋喃二甲酸产量提高的重组解鸟氨酸拉乌尔菌( Raoultellaornithinolytica) ，其特征在于，以解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)BF60为出发菌株，敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶中的至少3个，所述五个5-羟甲基糠醛还原酶为akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA；

编码醛酮还原酶的基因akR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码醇脱氢酶的基因aldR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码醇脱氢酶的基因AdhP1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，编码醇脱氢酶的基因AdhP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码2,5-二脱氢葡萄糖酸还原酶的基因dkgA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种构建权利要求1所述重组解鸟氨酸拉乌尔菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以pKD13质粒为模板，分别设计含有目标基因akR、aldR、AdhP1、AdhP2或dkgA两侧同源片段的引物扩增出需敲除目的基因的打靶片段；

(2)将(1)中所获得的任一打靶片段电转化入含有氯霉素抗性基因的pKD46质粒的R.ornithinolytica BF60中，涂布含有卡那霉素抗性的平板，通过菌落PCR验证获得阳性克隆菌株；

(3)高温培养(2)中所获得的阳性克隆菌，丢失掉温敏型pKD46质粒，然后电转化入pCP20质粒，高温培养消除卡那霉素抗性基因标记，采用不同抗性平板筛选出同时丢失掉pCP20质粒和卡那霉素抗性基因标记的突变株，此突变株即为目标基因缺失的解鸟氨酸拉乌尔菌；

(4)重复步骤(1)～(3)，以敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶基因中的至少3个。

3.一种生产2,5-呋喃二甲酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述重组解鸟氨酸拉乌尔菌的静息细胞为生物催化剂，以5-羟甲基糠醛为底物，催化生产2,5-呋喃二甲酸；按照1.5～5g细胞/g 5-羟甲基糠醛的用量进行催化反应；所述催化是在20～37℃下反应12～60h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组解鸟氨酸拉乌尔菌按下述步骤培养获得：

(1)种子液培养：挑取权利要求1所述的重组解鸟氨酸拉乌尔菌单菌落接种于液体LB培养基中，28～30℃、培养10～12h；

(2)菌体培养：将种子液以1～2％的接种量转接到TB培养基中，28～30℃培养16～36h。

5.权利要求1所述重组解鸟氨酸拉乌尔菌在食品、生物或化工领域用于制备含2,5-呋喃二甲酸的产品方面的应用。